I-A型CRISPR-Cas系统转录调控机制的研究

摘要

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated genes)系统是近年来发现的原核生物抵御入侵的病毒和质粒的获得性免疫系统。冰岛硫化叶菌REY15A编码Ⅰ-A型和Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统，其中Ⅰ-A型系统的免疫适应模块从外源入侵的病毒和质粒等遗传物质上获取DNA片段作为免疫记忆插入到CRISPR阵列中，从而获得针对特定外源入侵遗传元件的抵抗能力。获取间隔序列（即适应过程）是该系统的首要步骤，该过程需要Cas1、Cas2等蛋白将异己DNA片段加工、整合到CRISPR位点形成新间隔序列，然而参与此过程的蛋白及其调控机制尚不清楚。
　　本研究首先揭示了冰岛硫化叶菌Ⅰ-A型系统原发适应(de novo spacer acquisition)的转录调控机制。本研究发现Csa3a调控蛋白可以特异性结合csa1和cas1基因启动子;更重要的是在超表达csa3a基因的菌株中检测到csa1、cas1、cas2和cas4基因转录水平显著升高，同时Csa1和Cas1蛋白表达量显著增加。本研究进一步发现在含有csa3a超表达质粒的情况下，两个CRISPR位点都能检测到非常活跃的获取单个间隔序列的现象。新间隔序列的PAM主要是CCN，并且前间隔序列的选择是随机和不定向的。这些结果阐明了Csa3a转录调控蛋白感应入侵外源遗传元件并激活获得免疫相关基因表达，最终从入侵遗传元件上面获取间隔序列的原发型免疫适应机制。
　　本研究进一步揭示了Csa3a调控蛋白激活CRISPR RNA转录和DNA修复基因表达，以增强CRISPR适应和干涉的转录调控机制。本研究发现在冰岛硫化叶菌Ⅰ-A型CRISPR-Cas系统中获取间隔序列需要Csa1、Cas1、Cas2和Cas4四种蛋白，并且缺失加工成熟crRNA的基因或者干涉基因会导致菌株从自身基因组大量获取间隔序列。转录组和蛋白质组分析显示，超表达Csa3a蛋白可以激活获取相关的cas基因以及包括解旋酶herA、核酸酶nurA和DNA聚合酶Ⅱ在内的DNA修复基因的表达，同时增强CRISPR RNA的转录。体外EMSA实验表明，Csa3a蛋白能特异性结合到这些DNA修复基因的启动子区，说明Csa3a直接调控这些基因参与获取过程;Csa3a蛋白还能特异性结合leader序列从而激活CRISPR RNA转录。
　　综上所述，本研究揭示了冰岛硫化叶菌Ⅰ-A型CRISPR-Cas系统的调控机制，即Csa3a转录调控因子既可以调控参与获取过程的免疫适应基因和DNA修复相关基因，又能激活CRISPR RNA转录从而增强对入侵遗传元件的干涉能力。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 冰岛硫化叶菌

1．2 硫化叶菌的遗传操作体系

1．3 CRISPR-Cas系统

1．4 CRISPR-Cas系统的功能

1．5 CRISPR-Cas系统的分类

1．6 CRISPR-Cas系统的作用机制

1．6．1 免疫适应

1．6．2 CRISPR RNA转录和加工

1．6．3 DNA／RNA干涉

1．7 CRISPR-Cas系统的调控

1．8 Csa3a蛋白

1．9 本研究的目的和内容

2 材料与方法

2．1 菌株和质粒

2．2 培养基配方及培养条件

2．3 主要分子生物学试剂

2．4 主要实验仪器

2．5 实验方法

2．5．1 大肠杆菌DH5α感受态制备和热激转化法

2．5．2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法

2．5．3 染色体免疫共沉淀(CHIP)

2．5．4 RNA抽提和反转录荧光定量PCR

2．5．5 Western blot实验

2．5．6 Csa3a蛋白的表达和纯化

2．5．7 凝胶阻滞分析(EMSA)

2．5．8 DNase Ⅰ足迹实验

2．5．9 冰岛硫化叶菌生长曲线测定

2．5．10 转录组测序及分析

2．5．11 iTRAQ定量蛋白质组学分析

2．5．12 检测间隔获取及分析

3 结果与分析

3．1 cas基因簇的共转录分析

3．2 Csa3a蛋白结合csa1和cas1启动子的体内实验

3．3 Csa3a蛋白结合csal和cas1启动子的体外实验

3．3．1 Csa3a蛋白在csa1启动子上的结合位点

3．3．2 Csa3a蛋白在cas1启动子上的结合位点

3．4 Csa3a蛋白对acas基因簇表达的影响

3．4．1 转录水平检测Csa3a蛋白对acas基因簇转录的影响

3．4．2 翻译水平检测Csa3a蛋白对acas基因簇表达的影响

3．5 超表达Csa3a蛋白对CRISPR原发适应的影响

3．5．1 获取间隔序列的检测

3．5．2 新间隔序列的分析

3．6 Cas蛋白对于CRISPR原发适应的影响

3．6．1 各缺失菌株获取间隔序列的检测

3．6．2 干涉活性缺失菌株中新间隔序列的分析

3．6．3 获取新间隔序列时间及连续性的分析

3．7 超表达Cas3a蛋白对菌株生长的影响

3．8 鉴定被Cas3a蛋白调控的基因

3．8．1 通过转录组和蛋白质组初步筛选

3．8．2 EMSA实验鉴定Csa3a结合上调基因的启动子

3．9 Cas3a蛋白激活CRISPR转录

3．9．1 转录组数据中CRISPR RNA差异分析

3．9．2 Csa3a蛋白在前导序列上的结合位点

4 讨论与展望

4．1 Csa3a蛋白对acas基因簇的转录激活作用

4．2 Csa3a蛋白激活硫化叶菌原发适应的生理意义

4．3 Csa3a蛋白调控DNA修复基因的意义

4．4 硫化叶菌原发适应的必需基因及干涉活性对原发适应的影响

4．5 硫化叶菌I-A型CRISPR-Cas系统转录调控模型

参考文献

附录

研究生期间学术成果

致谢