粗毛羊和细毛羊初级毛囊基板发育期皮肤的转录组分析

摘要

羊毛是绵羊皮肤内毛囊产生的附属结构，是毛用绵羊的主要经济产物，羊毛细度在生产上是衡量毛用绵羊品质的主要特征之一。粗毛羊和细毛羊的毛纤维细度和长度差异显著。最明显的差异表现在由初级毛囊发育形成的外层羊毛，相关的比较研究目前鲜有报道。因此研究调控粗毛羊和细毛羊初级毛囊发育的分子网络，比较并探索皮肤和毛囊早期发育差异的分子调控机制，对于阐述羊毛粗细差异，改良羊毛品质，提高羊毛产量和质量具有重大的意义，并为毛用绵羊的分子育种提供一定的理论依据。
　　本研究选取绵羊胚胎特定发育时期一初级毛囊形态发生早期（胚胎期约65天，也称为初级毛囊基板期），运用RNA-seq技术对粗毛羊和细毛羊胚胎背部皮肤样品进行转录组分析比较，具体结果如下:
　　1.在初级毛囊早期发育时期，粗毛羊和细毛羊在形态学上存在显著差异比较研究初级毛囊形态发生特定时期（初级毛囊基板期）的皮肤形态学差异，发现粗毛羊的皮肤真皮层厚度和毛囊基板横截面积均大于细毛羊，且差异显著。
　　2.粗毛羊和细毛羊在初级毛囊基板期皮肤形态学差异的分子机制比较研究
　　(1)通过RNA-seq测序，比较分析初级毛囊基板期粗毛羊和细毛羊背部皮肤样品的转录组水平差异，检测到726个差异表达的基因。其中在粗毛羊样品中共计上调表达435个基因，下调表达291个基因。
　　(2)对差异基因进行GO分析，共有498个基因被富集到GO的生物过程、细胞组分和分子功能三大类，主要与形态发生、器官组织发育及细胞分化相关。KEGG pathway分析结果表明，差异基因主要位于与细胞形态、细胞的发育和增殖相关的通路，如“PI3K-Akt信号通路”、“MAPK信号通路”、“Focal adhesion”、“ECM-receptor interaction”、“Wnt信号通路”等。
　　(3)进一步分析发现，在皮肤内表皮、真皮和毛囊真皮凝集体中分别筛选到4个、31个和12个和发育相关的差异表达基因，这些差异表达的基因主要富集在Wnt、IGF以及FGF信号通路，表明这些基因是参与调控粗毛羊和细毛羊早期皮肤形态学差异的主要候选基因。
　　(4)选取9个差异表达的基因做qPCR验证分析，经检验发现FZD4，FZD9，DKK1，BAMBI基因具有显著的差异，并且与qPCR验证结果一致。
　　结论
　　本研究发现在胚胎发育早期，同等时期的粗毛羊与细毛羊在皮肤厚度和毛囊基板表面积存在显著差异，转录组比较分析发现差异表达的基因与皮肤真皮层以及毛囊真皮凝集体的发育高度相关，筛选出相关候选基因，推测其直接或间接调控粗、细毛羊早期发育的皮肤形态学差异。本研究是绵羊初级毛囊发育相关分子网络的初步探讨，希望在运用分子育种技术改良绵羊毛纤维品质中提供一定的理论基础。

目录

声明

摘要

常用中英文缩略词表

1 前言

1．1 课题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 毛囊的发生和发育过程

1．2．2 调控毛囊发育的分子机制

1．2．3 影响毛纤维粗细的信号通路

1．2．4 皮肤发育相关的信号分子

1．3 转录组测序技术

1．3．1 转录组测序简介

1．3．4 RNA-seq的技术应用及发展前景

1．4 研究目的意义

2 试验方法

2．1 试验材料

2．1．1 组织样品

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及其配制

2．2 研究方法

2．2．1 石蜡切片和HE染色

2．2．2 基因克隆

2．2．3 荧光定量PCR

2．3 转录组测序和生物信息学分析

2．3．1 建库测序流程

2．3．2 生物信息学分析流程

3 结果

3．1 粗毛羊和细毛羊皮肤形态学差异

3．1．1 粗毛羊和细毛羊成体毛干形态学差异

3．1．2 粗毛羊和细毛羊胚胎期皮肤毛囊形态学差异

3．2 粗毛羊和细毛羊皮肤组织(初级毛囊基板形成期，约E65天)转录组测序和生物信息学比较分析

3．2．1 测序数据质量检测

3．2．2 参考序列对比分析

3．2．3 转录组测序比较分析差异表达基因

3．2．4 差异表达基因的GO富集分析

3．2．5 差异表达基因的KEGG pathway分析

3．2．6 差异表达基因的功能分析

3．2．7 差异表达基因的蛋白互作网络

3．2．8 差异表达基因的转录因子分析

3．3 荧光定量PCR验证

4 讨论

5 小结

5．1 本研究结论

5．2 本研究的特色与创新点

5．3 本研究的不足之处及下一步的工作建议

参考文献

附录

致谢