水牛繁殖和泌乳性状候选基因筛选及IGFBP7基因功能解析

摘要

我国水牛种质资源丰富，既有沼泽型，又有河流型，主要用于耕地和产肉。近年来，随着水牛向乳用方向改良，奶水牛产业得到快速发展。水牛奶营养丰富全面、消化吸收率高，将水牛奶深加工成乳制品，如“乳豆腐”、“奶饼”、“双皮奶”等，深受消费者喜爱，具有广阔的市场前景。然而，尽管我国水牛存栏量多，但水牛产奶量和繁殖力低，目前为止还没有专门的乳用型水牛品种，从而影响奶水牛产业的进一步发展。
　　水牛的繁殖性状和泌乳性状均是重要的经济性状，为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多，通过传统方法选育高繁殖力和高产奶量奶水牛进展缓慢。目前，全基因组关联分析和转录组测序对研究数量性状提供了新的方向。因此，本研究利用全基因组关联分析和转录组测序方法对影响水牛繁殖性能和产奶性能的候选基因进行筛选与鉴定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遗传基础，为提高奶水牛的产奶性能和繁殖性能以及遗传改良提供理论基础。
　　1水牛繁殖性状候选基因分析
　　本试验分为三个部分。首先利用商业化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))对462头意大利地中海水牛的头胎产犊日龄、第二胎产犊日龄、第三胎产犊日龄、受精所需输精次数、空怀天数、产犊间隔6个繁殖性状进行全基因组关联分析。繁殖性状原始数据来自于意大利水牛育种评估中心。通过GWAS分析寻找影响水牛繁殖性状的SNP、基因组区域和候选基因。其次利用二代测序技术对四个时期(卵泡直径＜5mm，5～8mm，8～12mm和＞12mm)的水牛有腔卵泡颗粒细胞进行转录组测序，并进行定性和定量分析。根据GO和KEGG富集分析，寻找影响卵泡发育的候选基因。最后通过整合GWAS结果和转录组测序结果，鉴别影响水牛繁殖性能的关键候选基因，并利用RNAi技术对候选基因IGFBP7在水牛颗粒细胞中进行验证。主要结果如下:
　　(1)全基因组关联分析鉴别到与繁殖性状相关的40个SNP和28个候选基因。
　　(2)单倍型分析发现在5号染色体的2.3～2.7Mb区域存在一个与水牛繁殖性能相关的QTL区，其中多个SNP主要位于TRHDE基因内和附近的序列上。
　　(3)对水牛卵泡颗粒细胞的转录组分析鉴别出17700个基因，其中1076个基因在卵泡发育的不同时期差异表达显著，30个基因在卵泡发育的四个时期有差异表达。差异表达基因数最多的是卵泡发育的最后两个时期。
　　(4)差异表达基因在卵泡发育末期主要富集在免疫相关信号通路，提示该时期卵泡为排卵做准备。
　　(5)整合GWAS分析结果和转录组测序结果，发现与繁殖性状相关的28个候选基因中有25个基因在卵泡发育不同时期有表达，提示这些基因可能直接参与水牛卵泡发育的调控，从而影响水牛繁殖性能。
　　(6)IGFBP7基因在卵泡发育的4个阶段均有较高的表达量。水牛颗粒细胞用RNAi敲低IGFBP7后，增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均发生显著的变化。
　　2水牛泌乳性状候选基因分析
　　本试验分为两个部分。首先对1002头水牛的16个体型外貌指标与产奶量进行回归分析，筛选出与产奶量显著相关的体型外貌指标，并用地中海水牛群体对该指标进行验证。其次，根据获得的体型外貌指标，利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array对176头意大利地中海水牛进行基因分型，质控后，分别与关键体型外貌指标进行全基因组关联分析，寻找与体型外貌指标相关的SNP、候选基因和QTL。主要结果如下:
　　(1)通过体型外貌指标与泌乳量的分析，发现乳房性状与产奶量显著相关，乳房性状可做为水牛产奶量的直接或间接指标。
　　(2)对水牛前乳头长、后乳头长、前乳头间距、后乳头间距和前后乳距5个乳房性状的全基因组关联分析，共获得10个与乳房性状相关的SNP和5个候选基因，分别是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
　　(3)单倍型分析发现一个位于候选基因LRP2内的QTL显著影响水牛的乳房性状。对LRP2进行表达谱分析，发现LRP2在乳腺组织中高表达，推测该基因可能参与调控乳腺的发育以及在泌乳调控过程中参与乳蛋白和乳脂肪的重吸收。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 研究背景

2 水牛繁殖性能遗传研究进展

3 水牛泌乳性能遗传研究进展

3．1 水牛体型外貌与产奶量

3．2 水牛泌乳性状的主效基因

4 畜禽全基因组关联分析研究进展

4．1 泌乳性状的全基因组关联分析

4．2 体型外貌性状的全基因组关联分析

4．3 繁殖性状的全基因组关联分析

5 畜禽转录组分析研究进展

6 整合GWAS和转录组数据研究复杂性状

7 研究的目的和意义

1 引言

2 试验材料与方法

2．1 试验样本

2．2 主要试剂、仪器设备

2．3 试验方法

3 试验结果

3．1 全基因组基因多态性及其与水牛繁殖性状的关系

3．2 不同发育时期卵泡颗粒细胞中的差异表达基因

3．3 水牛繁殖候选基因及其功能

4 讨论

4．1 繁殖性状相关的候选基因

4．2 调控水牛卵泡发育的候选基因

4．3 候选基因功能

5 小结

6 研究不足

第三章 水牛泌乳性状候选基因分析

1 前言

2 试验材料和方法

2．1 试验样本

2．2 主要试剂、仪器设备

2．3 试验方法

3 试验结果

3．1 体型外貌指标与产奶量的相关分析

3．2 乳头性状的全基因组关联分析

3．3 LRP2基因多态性分析

4 讨论

4．1 体型外貌指标与产奶量的关系

4．2 全基因组多态性与水牛体型外貌性状的关系

4．3 单倍型对水牛的乳房形态性状和产奶性能的影响

4．4 候选基因LRP2的功能

5 小结

6 研究不足

参考文献

附录

已发表论文

致谢