a1，3-半乳糖苷转移酶基因靶向的RNA干扰抑制猪内皮细胞异种抗原性的实验研究

摘要

第一部分小分子干扰RNA转染猪内皮细胞优化体系的建立 【目的】本研究拟探索建立高效、稳定的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,SiRNA)转染方案并建立优化的猪内皮细胞RNAi转染体系，为研究RNAi在抑制异种排斥反应中的应用奠定基础。 【方法】针对猪体内存在的a1，3-GT基因的不同外显子设计并生物合成数对SiRNA分子(SiRNA-1、SiRNA-2及错配SiRNA)，运用不同脂质体转染体系(DOSPA、RiboJuice及Lipofectamine2000)分别转染原代PEC和永生化猪血管内皮细胞系SV-40-PED。分别应用流式细胞学检测、台盼蓝拒染试验及乳酸脱氢酶释放试验评价干扰a1,3-GT作用下PEC的a-Gal表达情况以及RNAi脂质体转染对PEC生长的影响。 【结果】原代PEC及内皮细胞系SV-40-PED均可有效发生特异性RNAi现象，且呈明显的剂量依赖性特征。SiRNA-1与脂质体RiboJuice在12nmol：6μl时干扰效果最佳(67.3％～89.5％)，整体量效优于DOSPA及Lipofectamine2000转染体系，2种靶细胞转染SiRNA-1后48h时的a-Gal相对表达水平分别为14.3％(原代PEC)和10.5％(SV-40-PED)，而SiRNA-2转染组则未见明显干扰现象。脂质体转染体系在转染后6～12h对靶细胞生长稍有影响，24h后细胞活性逐渐得以恢复。 【结论】猪内皮细胞存在RNAi机制，RiboJuice转染体系是一种高效、低毒的SiRNA转染方式，为进一步研究RNAi(RNAinterference)在抑制异种排斥反应中的应用奠定了良好基础。 第二部分a1，3-GT基因沉默的猪内皮细胞抗人血清补体细胞毒作用的功能研究 【目的】本研究旨在进一步评价RNAi对猪内皮细胞a1,3-GT基因及a-Gal蛋白表达的影响，以及探讨a1,3-GT基因沉默的猪内皮细胞是否具有抗人血清补体介导的细胞毒作用。 【方法】分别使用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光检测各转染组a1,3-GTmRNA及a-Gal蛋白表达，确认猪血管内皮细胞系SV-40-PED发生了RNAi效应。在流式细胞学检测中观察a-Gal表达下调对SV-40-PED结合抗体/补体能力的影响，并通过标准51Cr释放试验评价RNAi对人血清细胞毒效应的保护作用。 【结果】与错配组及空转染组相比，SiRNA-1转染组a1,3-GT基因的2个异构体mRNA表达量分别下降了69.0％和72.6％(P＜0.05)，而SiRNA-2转染组a1,3-GT表达量的差异无显著性意义(P＞0.05)。Westernblot和免疫荧光再次确认SV-40-PED在特异性SiRNA作用下发生了RNAi效应，蛋白电泳图谱显示分子量在66kDa～200kDa范围的蛋白质表达水平均有不同程度的下降，且66kDa～116kDa范围的蛋白质降低程度更为显著，几乎为痕量表达。SiRNA-1转染组a-Gal平均荧光强度(52.9)明显小于错配组(493.9，P＜0.01)及空转组(505.7，P＜0.01)，阴性对照ECV304细胞因无a-Gal表达呈现暗色背景。流式细胞学检测中，SiRNA-1组与空转染组相比，无论抗体还是补体结合水平均有不同程度的下降，抗体/补体下降程度依次为IgG44.8％，IgM68.1％和C3c51.4％(P＜0.05)。20％正常人血清(normalhumanserum，NHS)及40％NHS对空转染组和错配组SV-40-PED均有不同程度的杀伤能力，而SiRNA-1转染SV-40-PED后即可呈现出对此效应的保护作用，抑制补体介导细胞毒的效应分别为：20％NHS，69.5％；40％NHS，59.8％(P＜0.05)，使补体对SV-40-PED的杀伤率大幅度下降。空转染组和错配组间杀伤率无明显差异(P＞0.05)，热灭活正常人血清(heat-inactivatedNHS，HINHS)作为阴性对照对各组SV-40-PED均表现出背景毒性作用。 【结论】尽管未取得完全的a-Gal沉默效应，但短暂的a-Gal合成下调已能足够抑制体外补体介导的细胞毒反应，为抑制超急性排斥反应的研究提供了新的思路和策略。 第三部分a1，3-GT基因沉默对猪内皮细胞和人自然杀伤细胞相互作用的影响 【目的】本研究拟检测RNAi对猪内皮细胞和人自然杀伤细胞(naturalkiller,NK)相互作用的影响，探讨NK细胞直接杀伤猪内皮细胞作用的靶位点，观察RNAi可能存在的内皮细胞保护作用。 【方法】分别从粘附作用和杀伤效应的角度探讨RNAi对猪血管内皮细胞系SV-40-PED和人NK细胞系NK92相互作用的影响，并通过二者共培养上清的IFN-γ分泌水平评价NK92的活化状态。 【结果】SV-40-PED转染SiRNA分子后48h，无论在静止还是流动状态下，NK92在SiRNA-1转染组、错配组及空转染组对SV-40-PED细胞的粘附能力均无明显差异，3组NK92粘附细胞的数量分别为262±26、275±24和252±23(静止状态，P＞0.05)；132±12、125±15和110±20(流动状态，P＞0.05)。无论TNF-a刺激SV-40-PED与否，NK92对3组不同SV-40-PED的杀伤率在相同效靶比下无明显区别，但杀伤能力与效靶比成正相关。NK92与SV-40-PED共孵育早期即有反应性的IFN-γ分泌，其分泌水平较其自发分泌值增加了5倍(60.1±6.4pg/mlvs366.9±28.7pg/ml)。IFN-γ分泌达峰时间在共孵育后12h出现，随后IFN-γ表达逐渐下降。SiRNA-1转染组、错配组及空转染组在不同时间段的IFN-γ分泌值组间差异无显著性意义(P＞0.05)。 【结论】利用RNAi技术下调a-Gal后，并未引起NK92和SV-40-PED相互作用的明显改变。a-Gal可能并非是NK作用的靶位点，其表达量的高低对NK细胞的活化、粘附及杀伤能力不产生负性影响。NK细胞直接作用于猪内皮细胞的配体-受体学研究尚需更多、更直接的实验材料来证实。 第四部分RNA干扰联合低剂量GS-IB4凝集素诱导体外Accommodation模型的建立 【目的】本实验在前部分利用RNAi技术成功沉默猪内皮细胞a1,3-GT基因、减少a-Gal表达的基础上，试图在体外模拟异种移植物内皮细胞与人血清相互作用的过程，通过a-Gal特异性结合凝集素GS-IB4的刺激，探讨诱导适应现象发生的可行性。 【方法】SiRNA-1转染SV-40-PED后分别使用不同剂量GS-IB4(0.5、2和8μg/ml)刺激SV-40-PED4h，另设未转染SiRNA-1而单独接受不同剂量GS-IB4刺激SV-40-PED作对照组。分别以51Cr释放试验及抗体/补体结合试验观察SV-40-PED在正常人血清中适应现象的发生，并通过检测SV-40-PED细胞E-selectin及HO-1基因的表达，探讨体外内皮细胞适应发生的可能机制。 【结果】联合RNAi和低剂量GS-IB4刺激SV-40-PED可以明显抑制补体介导对内皮细胞的细胞毒作用。这一效应与单独使用RNAi相比，效果进一步增强。GS-IB4浓度在2μg/ml时即可呈现最大保护效应，20％NHS和40％NHS对SV-40-PED的特异性杀伤率分别为4.3％±0.8％和8.4％±2.3％(P＜0.01)。对照组单独使用GS-IB4剂量达到24μg/ml时，其抑制补体的细胞毒作用才具有显著性意义。流式细胞学检测发现SV-40-PED结合抗体/补体水平与GS-IB4的刺激无关。SV-40-PED转染SiRNA-1后接受HINHS刺激时的E-selectin表达水平与正常SV-40-PED接受HINHS刺激相比无明显差异(MFI：232.5vs201.8)，但如果联合使用GS-IB4预处理SV-40-PED，E-selectin表达则受到抑制，且其表达下调呈明显的GS-IB4剂量依赖性，其MFI值从0.5、2和8μg/ml依次为98.5、42.0及36.3。保护性基因HO-1的mRNA表达则在联合RNAi和低剂量GS-IB4处理后有明显的上调。 【结论】利用RNAi联合低剂量GS-IB4凝集素方案能成功诱导出猪血管内皮细胞的体外适应模型，a-Gal表达量的高低与适应的诱导呈负相关。

目录

论文说明：全文缩略语

引言

前言

第一部分 小分子干扰RNA转染猪内皮细胞优化体系的建立

材料与方法

结果

讨论

主要参考文献

第二部分 a1,3-GT基因沉默的猪内皮细胞抗人血清补体细胞毒作用的功能研究

材料与方法

结果

讨论

主要参考文献

第三部分 a1,3-GT基因沉默对猪内皮细胞和人自然杀伤细胞相互作用的影响

材料与方法

结果

讨论

主要参考文献

第四部分 RNA干扰联合低剂量GS-IB4凝集素诱导体外Accommodation模型的建立

材料和方法

结果

讨论

主要参考文献

文献综述 RNA干扰相关技术及其在移植免疫中的应用

攻读博士学位期间发表的第一作者论文

致谢