阿尔茨海默病中钙依赖性蛋白激酶A调节亚基Ⅱα磷酸化及其对PKA-CREB通路的影响

摘要

第一部分体外钙离子孵育对C57BL/6 小鼠脑神经元及PC12细胞内PKA-RⅡα分子量表达的影响
　　 目的:探讨cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA)调节亚基Ⅱα（RⅡα）在C57BL/6 小鼠脑神经元体外钙离子孵育及加入不同干扰因素条件下的表达变化。
　　 方法:取8只C57BL/6 小鼠前脑组织匀浆裂解随机分为8组，分别应用以下条件予以处理：匀浆后不孵育作为对照1，不作处理仅30℃孵育10min 作为对照2，应用2.5mmol/LCaCl2 孵育，CaCl2 孵育前加入钙离子螯合剂EDTA，CaCl2 孵育后加入EDTA再次孵育，CaCl2 孵育后加入碱性磷酸酶再次孵育，CaCl2 孵育前应用外源性PKA 绑定蛋白Ht31 孵育，CaCl2 孵育前应用无活性外源性PKA 绑定蛋白Ht31P 孵育；同时将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12 cell）随机分为8组，裂解后与前述做相同处理。应用Western blot 法检测脑组织及细胞内RⅡα的表达情况。
　　 结果：小鼠前脑组织及PC12细胞裂解产物中，对照组1和2 内RⅡα表观分子量为51kDa；与CaCl2 孵育后，RⅡα表观分子量为53kDa；若在CaCl2 孵育前加入EDTA，则RⅡα分子量为51kDa；CaCl2 孵育后加入EDTA 则其分子量为53kDa；CaCl2 孵育后加入碱性磷酸酶再次孵育，RⅡα分子量为51kDa；CaCl2 孵育前加入Ht31或Ht31P，RⅡα分子量皆为53kDa。
　　 结论:RⅡα的分子量升高变化与Ca2+有关，且能被磷酸酶逆转，与RⅡα的AKAP结合活性无关。
　　 第二部分 PC12细胞内钙离子超载对PKA 调节亚基 RⅡα表达的影响
　　 目的：探讨细胞内钙离子超载状态下PKA 各亚基的表达变化。
　　 方法：分别应用Aβ1-42 寡聚体及KCl 造成PC12细胞内钙超载。采用5μmol/L 及10μmol/L的Aβ1-4237℃条件下分别孵育PC12细胞30min，1h，2h，4h，12h，采用50mmol/L 及100mmol/L的KCl37℃条件下分别孵育PC12细胞5min，10min，20min，30min，60min。MTT 法检测细胞活性，Western blot 法检测细胞内RⅡα亚基的表达。
　　 结果：Aβ1-42 寡聚体及KCl 孵育PC12细胞后，皆对PC12细胞活性造成不同程度影响，随着孵育时间的延长细胞活性逐渐下降。Western blot 检测孵育后PKA 调节亚基RⅡα先出现蛋白分子量的升高现象，与第一部分结果相似，同时，随着孵育时间的延长，RⅡ分子量回到正常水平。
　　 结论：Aβ1-42 寡聚体及KCl 对PC12细胞有明显毒性作用，并可致RⅡα蛋白分子量升高，其后则恢复到正常水平。
　　 第三部分不同激酶抑制剂对RⅡα分子量变化的影响
　　 目的：研究不同激酶抑制剂对RⅡα分子量变化的影响，找出使得RⅡα分子量变化的具体激酶。
　　 方法：以5μmol/L的Aβ1-42 寡聚体37℃条件下孵育PC12细胞2h 及100mmol/L的KCl37℃条件下孵育PC12细胞20min 造成RⅡα分子量变化模型，以未处理的PC12细胞为空白对照，分别同时应用PKA 抑制剂H89、PKC 抑制剂Staurosporine、CaM抑制剂W-7，应用Western blot 检测各组RⅡα分子量表达变化。
　　 结果：5μmol/L的Aβ1-42 寡聚体处理PC12细胞2h 及100mmol/L的KCl 处理PC12细胞20min后，RⅡα分子量由51kDa 上升为53kDa，同时分别应用H89、Staurosporine，W-7后，仅W-7 能逆转这种分子量表达的变化。
　　 结论 RⅡα分子量的变化为CaMK 所致的磷酸化，这种磷酸化与PKA或PKC 无明显关系。
　　 第四部分Aβ1-42 对PC12细胞内PKA 活性的影响
　　 目的：研究Aβ1-42 孵育对PC12细胞内PKA 活性的影响方法研究Aβ1-42寡聚体不同孵育时间下对PKA活性的影响，PC12细胞随机分组如下：5μmol/L的Aβ1-42于37℃条件下分别孵育PC12细胞0min、30min、1h、2h、4h、12h，；研究不同干预条件下钙超载对PKA活性的影响，PC12细胞随机分组如下：对照组：不作任何干预，实验组：5μmol/L的Aβ1-42寡聚体于37℃孵育2h，10μmol/L的W-7处理1h，10μmol/L的W-7预处理1h+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h，50μmol/L的Ht31+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h，50μmol/L的Ht31P+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h。孵育后采用Western blot检测细胞内PKA磷酸化底物表达水平，以证实PKA活性变化。
　　 结果：Aβ1-42 寡聚体处理PC12细胞后细胞内磷酸化PKA 底物表达先升高后降低，单用W-7 对磷酸化PKA 底物表达无明显影响，Aβ1-42 寡聚体干预前W-7的加入抑制了磷酸化PKA 底物表达的升高，Ht31 及Ht31P的加入均对磷酸化PKA 底物表达无明显影响。
　　 结论：Aβ1-42 寡聚体所致细胞内钙超载显著影响了PKA的活性，W-7 抑制PKA 活性升高可能与其抑制了RⅡα磷酸化有关，PKA的活性变化与其AKAP 结合位点无关。
　　 第五部分钙离子超载对PC12细胞内CREB 活性的影响
　　 目的研究PC12细胞内钙离子超载状态下，CREB 活性的变化。
　　 方法：将PC12细胞随机分为对照组与实验组，对照组不作任何干预，Aβ1-42 实验组分组如下：W-7组、Aβ1-42组、W-7+Aβ1-42组，Aβ1-42+H89组、Aβ1-42+staurosporine组；KCl 实验组分组如下：W-7组、KCl组、W-7+KCl组，KCl+H89组、KCl+staurosporine组。孵育后采用Western blot 检测细胞内磷酸化CREB（pCREB）水平，以证实CREB活性变化。
　　 结果：Aβ1-42 及KCl 处理PC12细胞后细胞内pCREB表达增加，单用W-7 对pCREB表达无明显影响，Aβ1-42 及KCl 干预前W-7的加入抑制了pCREB表达的升高，H89的加入显著减少了pCREB的表达，staurosporine的加入对pCREB表达变化无明显影响。
　　 结论：Aβ1-42 及KCl 所致细胞内钙超载显著影响了CREB的激活，W-7 可抑制CREB的激活，可能与其抑制了RⅡα磷酸化有关，CREB的激活主要与PKA的活性相关，与PKC 无关。

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前言

第一部分 体外钙离子孵育对C57BL/6 小鼠脑神经元及PC12 细胞内PKA-RⅡα 分子量表达的影响

第二部分 PC12 细胞内钙离子超载对PKA 调节亚基RIIα 表达的影响

第三部分 不同激酶抑制剂对RⅡα 分子量变化的影响

第四部分 Aβ1-42 对PC12 细胞内PKA 活性的影响

第五部分 钙离子超载对PC12 细胞内CREB 活性的影响

综述 钙紊乱及其信号通路在阿尔茨海默病中的研究进展

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