调控ROCK通路对氧糖剥夺后少突胶质前体细胞增殖和分化的影响

摘要

本文主要从以下两个部分展开论述：
　　第一部分 大鼠脑少突胶质前体细胞的体外培养与鉴定
　　目的：探索SD大鼠脑少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的分离与体外培养方法，观察其体外生长、标志物表达及定向分化能力。
　　方法：取出生后3天内SD大鼠全脑，采用0.125％的胰蛋白酶消化后培养10天左右，获得原代混合胶质细胞，在恒温摇床180rpm振摇过夜并差速贴壁40分钟获得纯化的OPCs。采用少突胶质前体细胞标志物A2B5和NG2抗体对纯化后培养3天的细胞进行免疫荧光染色鉴定OPCs细胞纯度，并取OPCs诱导分化3天后进行少突胶质细胞标志蛋白MBP及O4的免疫荧光染色。
　　结果：采用胰蛋白酶消化法获取原代混合胶质细胞、振摇并差速贴壁法分离纯化能够得到纯度较高的OPCs，呈双极或三极形态，折光性强，免疫荧光染色显示95％细胞表达A2B5和NG2，经诱导分化后可表达MBP及O4。
　　结论：采用振摇并差速贴壁法自SD大鼠全脑可分离纯化获得纯度较高的少突胶质前体细胞，体外生长稳定，经诱导可分化为成熟的少突胶质细胞。
　　第二部分 调控ROCK通路对氧糖剥夺后少突胶质前体细胞增殖和分化的影响
　　目的：观察ROCK信号通路特异性抑制剂Y27632对氧糖剥夺（Oxygen-glucose deprivation,OGD）后少突胶质前体细胞增殖和分化的影响。
　　方法：培养SD大鼠的全脑少突胶质前体细胞，实验分为Control组、Control+Y27632组、OGD组、OGD+ Y27632组四组；对细胞进行OGD处理2h，取再灌后0h、3h、6h、12h、24h时间点，进行MTT检测细胞增殖活性，EDU检测S期细胞比例，应用流式细胞技术检测细胞周期的分布，western blot检测OPCs细胞p-ERK1/2、p-P38和p-JNK的表达情况，探讨干预后增殖情况及其机制。对细胞进行OGD处理2h，取4天后时间点，进行免疫荧光组化染色和western blot实验，检测细胞MBP蛋白表达情况，从而探讨干预后分化情况。
　　结果：与对照组相比，OGD组OPCs细胞增殖活性下降（6h和12h,P<0.01），同时处于S期细胞的百分率明显降低（0h、3h、6h和12h, P<0.01）；OGD+Y27632组相比于OGD组OPCs细胞增殖活性上升（6h和12h,P<0.01），同时处于S期细胞的百分率明显上升（0h、3h、6h和12h, P<0.01）。
　　OGD组p-ERK1/2表达量明显高于对照组（3h、6h和24h，P<0.01），p-P38表达量明显低于对照组（0h、3h和6h，P<0.05），p-JNK无明显变化；与OGD组相比，OGD+Y27632组p-ERK1/2表达量明显降低（3h、6h和24h，P<0.01），p-P38表达量明显增高（0h、3h和6h，P<0.05），p-JNK无明显变化。
　　与对照组相比，OGD组表达少突胶质细胞特异性蛋白MBP量明显增多（4d，P<0.01）；OGD+Y27632组比单纯OGD组表达少突胶质细胞特异性蛋白MBP的量进一步增加（4d，P<0.01）。
　　结论：氧糖剥夺后少突胶质前体细胞的增殖下降，Y27632特异性抑制ROCK信号通路促进氧糖剥夺后少突胶质前体细胞的增殖，提示ROCK信号通路参与了少突胶质前体细胞氧糖剥夺后增殖过程。同时MAPK信号通道中ERK1/2和P38的蛋白磷酸化参与ROCK信号通路对少突胶质前体细胞增殖的调控。
　　氧糖剥夺可促进OPCs的分化，Y27632特异性抑制ROCK可以进一步促进氧糖剥夺后OPCs的分化，提示ROCK信号通路在氧糖剥夺诱导OPCs分化的过程中有重要的调控作用。

目录

封面

声明

目录

第一部分 大鼠脑少突胶质前体细胞的体外培养与鉴定

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

实 验 结 果

讨论

参考文献

第二部分 调控ROCK通路对氧糖剥夺后少突胶质前体细胞增殖和分化的影响

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

实 验 结 果

讨论

参考文献

第三部分 文献综述

参考文献

附录

致谢

硕士期间已录用论文