生长停滞特异性基因6过表达在促进缺氧缺血骨髓间充质干细胞存活和心肌修复中的作用及机制研究

摘要

本文从以下几个方面进行论述： 第一部分 生长抑制特异性基因6过表达促进缺氧缺血骨髓间充质干细胞存活 目的:研究生长抑制特异性基因6过表达对缺氧缺血骨髓间充质干细胞存活的影响. 方法:分离纯化雄性 Spraque-Dawley(SD)成年大鼠(200-250g)骨髓间充质干细胞(MSCs),流式细胞术鉴定其表面标志.逆转录腺病毒系统将转导GFP基因和Gas6基因到 MSCs(MSCGas6),并将编码绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒空质粒转染的MSCs作为对照组(MSCNull).采用Western Blot和免疫荧光法检测Gas6基因在MSCs中的表达情况.在缺氧条件下(95%氮和5%二氧化碳)培养24小时.随后对细胞活力及凋亡情况进行评估,并定量检测培养物上清液细胞损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)含量.通过结扎SD雌性大鼠冠状动脉左前降支(LAD)产生心肌梗死.假手术组大鼠未进行冠状动脉结扎.通过观察结扎后左心室的苍白变色和心电图上的ST抬高来确认心肌梗死造模成功.在梗塞周围区域的5个不同部位注射5×106个 MSCNul或MSCGas6或单独等量PBS(50μl).在细胞移植后1,3和21天,使用聚合酶链式反应(Real-Time Polymerase ChainReaction)分析梗死心肌边缘区大鼠性别决定区的Y染色体(SRY)基因和GFP基因的表达情况.采用Western blot检测,阐明在缺氧条件下Gas6工程化MSCs存活增强的分子机制. 结果:在低氧条件下,MSCGas6显示出更高的存活力,且LDH释放明显减少.ELISA检测表明,Gas6基因工程构建的MSCs分泌的Gas6基因产物显著增加.流式细胞分析表明,Gas6过表达显著降低缺氧诱导的 MSC凋亡.在常氧条件下,MSCGa s6和MSCNull之间的存活率没有显着差异.蛋白质印迹显示,在缺氧24小时后,Axl磷酸化显著增加1.7±0.3倍,Akt磷酸化在在MSCGas6中增强2.1±0.3倍.此外,Bcl-2和Bax蛋白水平在缺氧的MSC中均增加,MSCGas6中的Bcl-2增加程度明显高于MSCNull(p<0.05),而MSCGas6中的Bax表达量与MSCNull对照相比明显减少(p<0.05).与MSCNull组相比,缺氧处理的MSCGas6组Bcl-2/Bax比率增加2.8倍.Axl siRNA敲低Axl的表达,显著抑制缺氧损伤的MSCGas6中Akt的磷酸化,阻断MSCGas6中的Bcl-2/Bax比率的增加和 caspase-3活性的降低,并极大地消除了 Gas6对缺氧性损伤的MSC的促存活和抗凋亡作用,并且加了MSCGas6的损伤标记物LDH的释放. 结论:我们的研究结果表明Gas6可以保护MSCs缺氧性损伤.Gas6工程化的MSCs预期在缺血心肌中保持其抗凋亡特性,促进心肌修复.增强的Gas6/Axl自分泌信号通过,或者至少部分地通过激活Akt以及提高下游抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白比例(Bcl-2/Bax),进而促进细胞存活. 第二部分 生长抑制特异性基因6过表达促进骨髓间充质干细胞旁分泌减轻心肌细胞凋亡 目的:通过构建过表达生长抑制特异性基因6骨髓间充质干细胞(MSCGas6),观察和探讨MSCGas6旁分泌作用,及其对缺氧缺血条件下心肌细胞存活和凋亡的影响,并探讨相关机制. 方法:收集上述在常氧和缺氧条件下各组MSCs的培养上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组MSCs培养基中的四种主要生长因子,包括:血管内皮生长因子(VEGF),和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和基质细胞衍生因子(SDF)的分泌水平.通过siRNA干扰实验和通路阻断剂干预实验,研究缺氧条件下 MSCGas6的四种生长因子的分泌及相关机制.为了进一步评估MSCs释放的生长因子对缺氧损伤后新生大鼠心肌细胞(NRCMs)的影响,我们从缺氧处理24小时的MSCGas6或MSCNull收集无血清条件培养基.产生条件培养基(CM)如下:将MSCNull或MSCGas6置于无血清Iscove's改良的Dulbecco's培养基(IMDM)缺氧培养24小时,收集培养基并用于体外实验.分离培养新生大鼠心肌细胞(NRCMs).体外研究中,在缺氧条件下(95%N2和5%CO2),将心肌细胞与来自MSCs的普通培养基(NM)或条件培养基(CM)中培养24小时.通过MTS测定法检测心肌细胞活力,通过TUN EL染色评估心肌细胞凋亡情况. 结果:酶联免疫吸附测定(ELISA)显示,两组MSCs缺氧处理后VEGF,bFGF,SDF和IGF-1的分泌水平均增加.与MSCNull相比,MSCGas6的VEGF分泌增加超过85%, bFGF增加约67%,SDF增加58%,IGF-1增加32%.然而,在正常条件下培养M S C时,各组之间生长因子分泌量没有显着差异.Axl敲低,显著阻断了缺氧条件下MSCGas6中核 HIF-1α蛋白的上调(降低超过34%),同时明显抑制了缺氧条件下MSCGas6的四种生长因子的分泌(分别减少超过38%,33%,30%,23%).并且, HIF-1α的沉默导致缺氧时MSCGas6分泌VEGF,bFGF,SDF和IGF-1显著下降.另外,特异性PI3K/Akt抑制剂LY294002阻断了Gas6诱导的核HIF-1α蛋白水平的增加.TUNEL检测显示,与MSCNull(CM-MSCNull)条件培养基培养下心肌细胞凋亡细胞核数(7.2±1.3%)和正常培养基(NM)(16±2.6%)相比,在低氧处理的CM-MSCGas6条件培养基(CM-MSCGas6)共培养下的心肌细胞凋亡细胞核数减少到4.2±0.9%(p<0.05),心肌细胞凋亡显著减少.通过MTS测定评估24小时缺氧培养后心肌细胞活力.在正常培养基中进行低氧处理后,NRCMs的活力与常氧对照相比显着降低约65%.与CM-MSCNull相比,CM-MSCGas6培养条件下的活性NRCM数量增加约33%.CBO-P11,PD-161570,AMD3100和PPP极大地抑制了Gas6诱导的细胞保护作用. 结论:基因工程化MSCs通过其增强的Gas6/Axl自分泌信号,可以有效促进缺氧条件下生长因子VEGF,bFGF,SDF和IGF-1分泌增加,进而保护新生大鼠心肌细胞免于缺氧损伤.Gas6在缺氧条件下通过 Axl/Akt/HIF-1α级联信号促进了 VE GF, bFGF,SDF和IGF-1的分泌. 这些结果强烈支持我们的假设,即Gas6修饰的MSC通过旁分泌的细胞保护机制,对心肌细胞产生更强的保护效应. 第三部分 生长抑制特异性基因6过表达的骨髓间充质干细胞移植改善心功能异常并促进心脏修复 目的:通过构建心肌梗死模型,观察和探讨生长抑制特异性基因6过表达的骨髓间充质干细胞移植对心功能异常和心肌损伤的影响. 方法:通过结扎SD雌性大鼠冠状动脉左前降支(LAD)产生心肌梗死.假手术组大鼠未进行冠状动脉结扎.通过观察结扎后左心室的苍白变色和心电图上的 ST抬高来确认心肌梗死造模成功.在梗塞周围区域的5个不同部位注射5×106个MSCNull或MSCGas6或单独等量PBS(50μl).在细胞移植3周后超声心动图评估心脏功能,评估指标包括左室射血分数(LVEF),左室短轴缩短率(FS),左心室舒张末期内径(LVEDD)和左心室收缩末期内径(LVESD).随后将心脏在4%多聚甲醛溶液中固定并包埋在石蜡中,用Trichrome-Masson染色以确定梗死面积.使用Image J软件测量瘢痕的长度和整个周长.瘢痕范围计算为疤痕和心室大小的比例,并以百分比表示.从三个横截面测量的平均值用于统计分析. 结果:超声心动图检查显示,与假手术组相比,心肌梗死组大鼠心功能明显下降,具体表现在左室短轴缩短率(FS)和射血分数(LVEF)明显下降,而左室舒张末期内径(LVEDD),左室收缩末期内径(LVESD)和室间隔厚度(IVS)显著升高.心肌梗死3周后,MSCGas6组大鼠左室功能(LVEF:46.3±6.8%; FS:34.1±4.19%; LVEDD:5.4±0.5mm; LVESD:4.5±0.5mm),与MSCNull组大鼠(LVEF:37.4±4.9%; FS:28.9±3.3%; LVEDD:6.3±0.7mm; LVESD:5.3±0.6mm)相比明显改善(p<0.05).与PBS处理组相比,MSCGas6和MSCNull组均显示心功能显著改善.此外,masso n-trichrome染色显示,与PBS对照组(46.5±4.9%)相比,两组均显示出明显减少的瘢痕程度,MSCGas6组梗死面积(15.7±3.5%)比MSCNull组(20.6±3.3%)减少24%(p<0.05). 结论:心肌内移植Gas6过表达的MSCs可显著改善心肌梗死后的心功能并限制梗死面积,提高骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的疗效.

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