黄瓜抗病基因同源序列的克隆及其对霜霉病抗病基因标记的研究

摘要

由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的黄瓜霜霉病(Downymildew)是当前严重影响黄瓜生产的主要病害之一,1868年首次被发现,近年来日趋严重.防治霜霉病可采取喷施杀菌剂和高温闷棚等措施,但根本途径是培育抗霜霉病的黄瓜优良品种.克隆和标记黄瓜霜霉病抗病基因,则是当前利用分子技术进行抗病育种工作的基础.该试验采用基于抗病基因同源序列(Resistance gene analog,RGA)克隆和标记基因的策略,主要进行了以下3方面的研究:(1)依据抗病基因的NBS保守域设计简并引物,从黄瓜基因组DNA中克隆RGA;(2)构建黄瓜抗感霜霉病分离群体,并用于从上述克隆到的RGA中筛选黄瓜霜霉病抗病基因的连锁标记;(3)利用获得的黄瓜RGA分析黄瓜的种质资源,考察RGA在黄瓜抗病种质资源上的聚类分析效果.该试验在实验方法上有所创新.首次采用PCR-PAGE方法对RGA的克隆进行分类,与四碱基酶切分类方法相比较,该方法能够全面分析待测的克隆核苷酸序列,PCR扩增不受载体序列干扰、无需酶切鉴定可以直接去除非重组克隆,同时还可以对重组克隆进行是否为目的片段克隆的PCR验证.该方法在对电泳谱带的分析上也比较简便,只需对目的电泳带进行长度的归类,借助图象扫描分析软件可轻易完成.综上所述,该试验证实了NBS类型RGA在黄瓜基因组中广泛存在,并与甜瓜RGA有较高同源性;该试验还初步验证了黄瓜RGA同某些抗病基因之间可能存在的连锁关系;该试验还首次尝试使用RGA的特异引物分析植物品种间的遗传关系,初步证明黄瓜RGA对抗病种质有一定的标示作用.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1研究的目的和意义

1.2植物抗病基因及其同源序列的研究现状与分析

1.2.1植物抗病反应的分子机理

1.2.2植物的抗病基因

1.2.3植物抗病基因同源序列

1.3黄瓜抗霜霉病研究现状与分析

1.3.1病原菌的研究

1.3.2黄瓜霜霉病的抗性遗传研究

1.3.3黄瓜霜霉病的抗病机制研究

1.4分子标记及其在黄瓜上的应用现状与分析

1.4.1分子标记技术概述

1.4.2分子标记在黄瓜上的应用与分析

1.5本试验的主要研究内容

2材料和方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2试剂与设备

2.2方法

2.2.1黄瓜霜霉病抗性鉴定

2.2.2黄瓜白粉病成熟期自然发病抗性鉴定

2.2.3黄瓜DNA的提取

2.2.4引物设计

2.2.5 PCR反应条件

2.2.6简并引物PCR扩增产物的克隆、分类和测序

2.2.7黄瓜霜霉病抗病基因的CsRGA连锁分析

2.2.8基于DNA标记的霜霉病抗性种质资源聚类分析

3结果与分析

3.1黄瓜基因组DNA中RGA的分离、分析和鉴定

3.1.1黄瓜基因组DNA中RGA的分离

3.1.2黄瓜基因组DNA中NBS类型RGA的分析

3.1.3黄瓜基因组DNA中CsRGA的PCR鉴定

3.2黄瓜RGA对霜霉病抗病基因(dm)的标记

3.3 CsRGA等标记对24个黄瓜品种的聚类分析

3.3.1 24个主要黄瓜品种的抗病性鉴定

3.3.2基于CsRGA3等几种标记的聚类分析

4讨论

4.1黄瓜基因组中RGA的克隆及其特征

4.2基于RGA的黄瓜霜霉病抗病基因标记

4.3基于RGA标记的黄瓜种质资源分析

4.4本试验的创新之处

5结论

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢