不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别四种禽病的初步研究

摘要

本研究建立了一种基因芯片结合不对称RT-PCR鉴别诊断禽流感（Avian influenza，AI）及其主要亚型（H5, H7, H9 和N1，N2）、鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）、新城疫（Newcastle disease，ND）、鸡传染性法氏囊（Infectious bursal disease，IBD)的基因芯片检测方法。以禽流感病毒的的M基因，HA基因和NA基因，鸡传染性支气管炎病毒的NP基因, 新城疫病毒的NP基因, 鸡传染性法氏囊病毒的A节段基因构建重组质粒。以重组阳性质粒为模板PCR扩增四种疾病的目的基因，PCR产物纯化后作为探针点到氨基修饰的载玻片上。样品RNA提取后, 以Cy3标记的反向引物和非荧光引物进行RT-PCR扩增，将荧光素引入PCR产物中。扩增处理后与芯片杂交、扫描，结果表明杂交模式与预期相符，无交叉反应。本研究旨在证明基因芯片结合不对称RT-PCR可有效地同步鉴别诊断禽流感及其主要亚型、鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病四种禽病，研究内容主要包括。
　　 1．探针的制备：根据GenBank 上公布的禽流感病毒序列，设计了针对禽流感病毒的M 基因，H5、H7、H9 亚型HA 基因，N1、N2 亚型NA 基因的引物，并设计了鸡传染性支气管炎病毒NP 基因、新城疫病NP 基因、鸡传染性法氏囊A 节段基因以及看家基因GAPDH 的特异性引物，并构建重组质粒。以重组质粒为模板，用PCR 方法扩增纯化后，制备点样探针。
　　 2．诊断芯片的制备和反应条件的优化：参照有关文献，将已制备的探针按照设计好的阵列，点制到氨基修饰的载玻片上，制成芯片。在样品的处理中，用常规方法从待检样品中提取RNA，以Cy3标记的反向引物和非荧光引物进行RT-PCR扩增，将荧光素引入PCR产物中，并对扩增条件进行优化。
　　 3．诊断芯片的效能评价：在相同条件下，提取H5-AIV、H7-AIV、H9-AIV、NDV、IBV、IBDV、H5+H7+H9 AIV混合物、IBV+IBDV+NDV混合物的RNA，按优化后的反应条件进行扩增，处理后与芯片杂交、扫描来检测芯片的特异性。将质粒溶液稀释至不同滴度，分别应用芯片方法和PCR方法检测，比较两种方法的灵敏度。实验还评价了该诊断芯片的重复性和保存期。
　　 特异性实验显示该诊断芯片可以特异性地与目的样品杂交，无交叉反应；敏感性实验中，当RT-PCR的结果已不能给出准确的判断，此诊断基因芯片的杂交信号仍然很强；经过实验评估证明此诊断芯片重复性良好，并且在室温密闭条件下可至少保存60天以上而不影响检测效果。
　　 ４．诊断芯片的样品检测及比较试验：分别用芯片、RT-PCR、鸡胚接种检测人工感染样品棉拭子及组织样品30份，记录检测结果，并计算符合率为100％和96.7％。现地收集的病死鸡样品57份，用鸡胚增殖后进行RT-PCR，同时对样品直接进行芯片检测，比较两种检测方法，结果表明，基因芯片与鸡胚增殖后进行RT-PCR的符合率为96.4％。通过研究结果表明，此基因芯片检测方法可以用于同步鉴别四种禽病以及现地主要流行的禽流感亚型，特异性强，并且敏感性比RT-PCR 技术高，具有重复性好，检测快速、准确，高通量等特点，是一种有效的新方法。此项研究给未来禽病高密度集成化诊断芯片的研制提供了一个较为可行的思路，为进一步基因芯片诊断产品的推广应用奠定了基础。