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【6h】

大豆GmWRKY20基因干涉及其表达研究

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摘要

1 引言

1.1 研究的目的和意义

1.2 文献综述

1.2.1 植物WRKY转录因子研究进展

1.2.2 RNAi干扰研究进展

1.3 本研究的课题来源及研究内

1.3.1 本研究的课题来源

1.3.2 本研究的研究内容及技术路线

2 材料与方法

2.1 GmWRKY20基因RNAi片段设计

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.2 GmWRKY20基因沉默植物表达载体构建

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验方法

2.3 GmWRKY20i对大豆遗传转化及抗性植株获得

2.3.1 试验材料

2.3.2 试验方法

2.4 抗性植株的PCR检测

2.4.1 试验材料

2.4.2 试验方法

2.5 抗性植株RNAi效果的分子生物学验证

2.5.1 试验材料

2.5.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 GmWRKY20基因RNAi片段设计

3.2 GmWRKY20基因沉默植物表达载体构建

3.2.1 RNAi片段的克隆

3.2.2 RNAi载体构建

3.3 GmWRKY20i对大豆遗传转化

3.3.1 pBWR植物表达载体对农杆菌的转化

3.3.2 植物表达载体pBWR对大豆转化及抗性植株获得

3.4 抗性植株的PCR检测

3.4.1 转pBWR载体T0代植株的PCR检测

3.4.2 转pBWR载体T1代植株的PCR检测

3.5 抗性植株RNAi效果的分子生物学验证

3.5.1 转pBWR载体T2代植株的RT-PCR检测

3.5.2 PCR阳性植株real-time PCR检测

4 讨论

4.1 基因敲除技术方法的选择

4.2 RNAi技术介导基因沉默需要注意的问题

4.3 GmWRKY20基因介导ABA信号调控抗旱、早花的生理与分子机理

4.4 下一步工作展望

5 结论

5.1 设计出了GmWRKY20基因沉默的RNAi片段并将其转化到大豆东农50中

5.2 获得了四个GmWRKY20基因沉默株系

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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摘要

在拟南芥中的研究发现,野生大豆GsWRKY20过量表达能提高拟南芥的耐旱性和提前开花。然而,基因的异源表达可能会导致表型出现异常,并不能正确解读基因的功能。为进一步明确GsWRKY20基因的功能,需获得GsWRKY20基因突变的植物材料。野生大豆来源的GsWRKY20基因与栽培大豆中GmWRKY20(GI:571469572)的核酸序列具有99.4%的相似度,氨基酸相似度完全一致,蛋白质二级结构相同。本研究使用RNAi技术,创制Gm WRKY20基因沉默大豆材料,为进一步研究Gm WRKY20基因功能和分子机制奠定基础。 首先从phytozome大豆基因组数据库中得到Gm WRKY20基因的CDS区序列,并找到与GmWRKY20同源的基因,通过多序列比对,在GmWRKY20非保守区设计RNAi片段,保证特异性沉默GmWRKY20基因,不干扰Gm WRKY20基因的同源基因表达。设计内含子片段PDK(公司合成),构建GmWRKY20基因RNAi正向片段-内含子PDK-RNAi反向片段的重组DNA,并与植物表达载体骨架pBEOM重组,形成GmWRKY20基因沉默植物表达载体。并将已构建好的RNAi植物表达载体转化到农杆菌(EHA105a),通过农杆菌介导大豆子叶节法,对大豆DN50进行遗传转化,以除草剂(草丁膦)进行抗性苗筛选,对抗性苗T0代、T1代植株进行PCR检测、RT-PCR、Real-timePCR检测,以确定RNAi介导基因沉默效果,最终获得GmWRKY20基因沉默的转基因株系。为进一步研究GmWRKY20基因功能提供基因表达沉默的突变体材料。本研究获得的主要研究结果如下: 1.构建了GmWRKY20基因RNAi植物表达载体并获得了转基因植株 以GmWRKY20基因非保守区为RNAi片段,PDK为内含子,依次将RNAi正向片段-内含子-RNAi反向片段连接,以pBEOM为双子叶植物表达载体骨架,成功构建Gm WRK Y20基因RNAi植物表达载体-pBWR。 以大豆东农50为受体材料,通过农杆菌介导法对大豆子叶节进行遗传转化,获得了转GmWRKY20i的抗性植株,T0代检测出PCR阳性植株2株,T1代检测出PCR阳性4株,RT-PCR阳性植株为4株。 2.鉴定出了GmWRKY20基因下调植株 以RT-PCR阳性的植株为材料,对转基因大豆中GmWRKY20基因的表达量进行Real-time PCR分析,GmWRKY20基因表达量明显低于野生型植株,由此表明,GmWRKY20基因的表达量受到RNA干扰。最终获得4个Gm WRK Y20基因沉默的大豆材料:DP8、DP15、DP17和DP19。其中,DP8植株Gm WRKY20基因下调20倍左右,DP19植株Gm WRKY20基因下调10倍左右。

著录项

  • 作者

    刘冬冬;

  • 作者单位

    东北农业大学;

  • 授予单位 东北农业大学;
  • 学科 生物学;遗传学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 柏锡;
  • 年度 2014
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 肿瘤学;
  • 关键词

    大豆; 基因干涉;

  • 入库时间 2022-08-17 10:34:17

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