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超滤离心在双水相萃取谷氨酸脱羧酶中的应用

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摘要

1 引言

1.1 GAD概述

1.1.1 GAD的分布与性质

1.1.2 GAD的结构与功能

1.1.3 GAD分离提取的研究概况

1.2 双水相萃取技术概述

1.2.1 双水相萃取的原理

1.2.2 双水相萃取技术的特点

1.2.3 双水相萃取技术的影响因素

1.2.4 双水相萃取技术的研究进展及应用

1.2.5 双水相萃取技术的局限性及展望

1.3 超滤离心的原理与特点

1.4 影响超滤离心的因素

1.5 超滤离心的应用

1.6 研究的工艺流程

1.7 研究的目的与意义

1.8 主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与培养基

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要设备

2.2 大肠杆菌GAD粗酶液的制备

2.2.1 大肠杆菌细胞的收集

2.2.2 大肠杆菌GAD粗酶液的提取

2.4 PEG-柠檬酸钠双水相萃取GAD体系的构建

2.4.1 PEG-柠檬酸钠双水相相图的建立

2.4.2 PEG-柠檬酸钠双水相萃取GAD体系的建立

2.5 双水相萃取GAD条件的确定

2.5.1 PEG分子量对GAD萃取的影响

2.5.2 PEG浓度对GAD萃取的影响

2.5.3 柠檬酸钠浓度对GAD萃取的影响

2.5.4 pH对GAD萃取的影响

2.5.5 NaCl添加量对GAD萃取的影响

2.6 超滤离心分离GAD与PEG

2.7 GAD与PEG的收集

2.8 检测方法

2.8.1 GAD的活力测定

2.8.2 蛋白质含量的测定

2.8.3 PEG含量测定

2.9 计算方法

2.10 统计分析

3 结果与分析

3.1 PEG-柠檬酸钠双水相体系相图

3.2 PEG-柠檬酸钠双水相萃取GAD条件的确定

3.2.1 PEG分子量对GAD萃取的影响

3.2.2 成相物质的浓度对GAD萃取的影响

3.2.3 pH对GAD萃取的影响

3.2.4 NaCl添加量对GAD萃取的影响

3.3 PEG-柠檬酸钠双水相萃取GAD正交试验

3.4 超滤离心分离GAD与PEG工艺参数的优化

3.4.1 单因素试验

3.4.2 响应面法优化超滤离心的工艺参数

3.5 GAD与PEG的收集

4 讨论

4.1 PEG分子量对GAD萃取的影响

4.2 成相物质浓度对GAD萃取的影响

4.3 pH对GAD萃取的影响

4.4 NaCl添加量对GAD萃取的影响

4.5 超滤离心分离回收GAD与PEG

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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摘要

双水相萃取技术(ATPS)是一项既环保又便捷的生物分离技术,它可以使目标产物富集到单一相中,既可以使目标产物达到纯化的目的,又不破坏目标产物的生物活性。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)属于大肠杆菌(Escherichia coli AS1.505,E.coli)的胞内酶,要想从大肠杆菌中获得GAD,需要对E.coli进行超声细胞破碎,然而,其细胞破碎匀浆液中含有培养物、细胞碎片等杂质,这就对获得高纯度的GAD造成了一定的困难。为了克服这一难题,本研究采用了一种新型萃取技术——双水相萃取技术,用以萃取经超声细胞破碎处理后的GAD酶液,并对GAD进行高效纯化分离。但是,双水相萃取技术只能将GAD萃取到单一相中,存在GAD与成相物质分离难的问题,从而限制了双水相萃取技术的发展。为了解决这个问题,本文利用双水相萃取技术将E.coli细胞破碎匀浆液中的GAD提取到PEG相中之后,再采用超滤离心方法将GAD与PEG分离,并分别回收GAD与PEG,主要研究内容如下: (1)建立双水相体系。对不同分子量PEG与柠檬酸钠的相图进行研究,选择符合成相条件的PEG和柠檬酸钠的浓度,建立PEG-柠檬酸钠双水相体系。 (2) PEG-柠檬酸钠双水相体系分离纯化GAD。利用所建立的PEG-柠檬酸钠双水相体系从超声破壁后的E.coliGAD粗酶液中萃取GAD。研究了PEG-柠檬酸钠双水相体系中成相物质PEG的分子量、PEG的质量浓度、柠檬酸钠的质量浓度、pH及NaCl的添加量等因素对E.coliGAD萃取过程中GAD的分配系数、蛋白质的分配系数、GAD的提取率以及纯化倍数的影响,通过正交试验对PEG-柠檬酸钠双水相体系分离纯化GAD的条件进行优化。 (3)超滤离心方法分离GAD与PEG并分别回收。初步研究了用超滤离心方法将GAD从成相物质PEG中分离出来并分别回收了GAD和PEG,探讨了影响超滤离心分离效果的因素,并采用Box-Behnken中心组合设计原理,以GAD的回收率为响应值,设计三因素三水平的响应面分析试验,对超滤离心工艺参数进行优化。 研究结果表明,PEG与柠檬酸钠可以构建双水相相图,PEG-柠檬酸钠双水相体系能够将E.coliGAD有效提取到PEG相中。PEG-柠檬酸钠双水相体系提取GAD的最适工艺条件为:成相物质PEG的分子量为1000、PEG的质量浓度为29%、柠檬酸钠的质量浓度为14%以及NaCl的添加量为2%,在此条件下,其萃取效果最好,GAD的纯化倍数达4.52。根据响应面的分析结果,超滤离心的最适工艺参数为超滤离心转速10000r/min、超滤离心时间20min、稀释倍数4.5倍,此时,GAD的回收率可达90.87%,PEG的回收率达91.49%。 本研究利用双水相萃取技术与超滤离心方法的结合使用,分离并回收GAD和PEG,即得到高纯度的GAD,又减少试剂消耗,降低成本,节能环保。双水相萃取技术结合超滤离心方法为解决GAD易于双水相萃取,却难于与成相物质分离的问题提供一定思路,使工业上提取GAD更加便捷,对于工业萃取酶制剂方面更具实际应用价值。

著录项

  • 作者

    李海鑫;

  • 作者单位

    东北农业大学;

  • 授予单位 东北农业大学;
  • 学科 食品工程
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 孙波,顾立文;
  • 年度 2014
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 肿瘤学;
  • 关键词

    超滤离心; 双水相萃取; 谷氨酸脱羧酶;

  • 入库时间 2022-08-17 10:34:17

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