声明
摘要
1 前言
1.1 奶牛乳腺组织的发育
1.2 miRNAs的研究现状
1.2.1 miRNAs的发现以及命名
1.2.2 miRNAs生物学特征
1.2.3 miRNAs的生成过程
1.2.4 miRNAs的功能
1.2.5 miRNAs的检测技术
1.3 miRNA与奶牛乳腺发育的研究现状
1.4 miR-486的研究概况
1.5 Pten基因的研究
1.6 研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂和耗材
2.1.3 主要仪器
2.1.4 RNA提取
2.1.5 RNA质量检测
2.1.6 实时荧光定量PCR
2.2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达
2.2.1 主要试剂和耗材
2.2.2 主要仪器
2.2.3 原位杂交具体步骤
2.3 靶向奶牛Pten基因的bta-miR-486荧光素酶载体构建
2.3.1 主要试剂和耗材
2.3.2 主要仪器
2.3.3 靶基因的预测
2.3.4 奶牛乳腺组织总RNA的反转录
2.3.5 目的片段的扩增与纯化
2.3.6 含目的片段的T载体质粒构建与测序
2.3.7 含目的片段的荧光素酶报告基因重组质粒载体的构建与测序
2.4 靶基因验证
2.4.1 主要试剂和耗材
2.4.2 主要仪器
2.4.3 HEK-293细胞的传代培养
2.4.4 双荧光素酶活性的检测
2.5 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定
2.5.1 主要试剂和耗材
2.5.2 主要仪器
2.5.3 奶牛乳腺上皮细胞的培养
2.5.4 乳腺上皮细胞鉴定
2.6 bta-miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞的影响
2.6.1 主要试剂和耗材
2.6.2 主要仪器
2.6.3 miR-486 mimics转染奶牛乳腺上皮细胞
2.6.4 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响
2.6.5 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响
2.6.6 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响
2.6.7 miR-486 mimics对乳腺上皮细胞的影响
2.6.7 免疫组化
2.7 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞的影响
2.7.1 主要试剂和耗材
2.7.2 主要仪器
2.7.3 miR-486 inhibitor转染奶牛乳腺上皮细胞
2.6.4 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响
2.7.5 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响
2.7.6 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响
2.7.7 miR-486 inhibitor对乳腺上皮细胞的影响
2.7.8 免疫组化
2.8 数据统计处理与统计分析
3 结果
3.1 奶牛乳腺组织RNA提取质量检验结果
3.2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达
3.3 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异
3.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养及鉴定
3.5 靶向奶牛Pten基因的miR-486荧光素酶载体构建
3.5.1 miR-486靶基因预测结果
3.5.2 报告基因载体的构建与鉴定
3.5.3 荧光素酶活性检测
3.6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞的影响
3.6.1 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响
3.6.2 miR-486超表达对奶牛上皮细胞活性的影响
3.6.3 miR-486超表达对奶牛上皮细胞DNA增殖率的影响
3.6.4 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响
3.6.5 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达
3.6.6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响
3.6.7 miR-486超表达对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果
3.7 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞的影响
3.7.1 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响
3.7.2 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞活性的影响
3.7.3 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞细胞DNA增殖率的影响
3.7.4 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响
3.7.5 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达
3.7.6 miR-486基因沉寂对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响
3.7.7 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果
4 讨论
4.1 靶基因的预测及鉴定
4.2 miR-486在奶牛乳腺组织的表达
4.3 miR-486对乳腺上皮细胞泌乳信号转导途径的影响
4.4 miR-486对奶牛乳腺细胞增殖和泌乳的作用及其机制
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文