氨基胍对iNOs诱导NO下游产物的影响及推荐剂量的应用实验

摘要

骨关节炎是一种关节软骨慢性、退行性疾病。发病较为普遍。虽然其病因至今仍不明确，但是一氧化氮已经被确认在骨关节炎的发生和发展过程中扮演着十分重要的角色。一氧化氮会抑制软骨细胞的增殖，抑制软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，促进软骨细胞的凋亡，并刺激软骨细胞分泌炎性因子。骨关节炎发病过程中，诱导一氧化氮产生的是诱导型一氧化氮合酶作用于软骨细胞的结果。氨基胍是一种选择性一氧化氮合酶抑制剂。本研究使用氨基胍作为干扰因素来研究与骨关节炎相关的炎性因子的表达。对氨基胍作用于软骨细胞后炎性因子的分泌情况进行检测，了解氨基胍影响骨关节炎的途径，为骨关节炎的有效治疗提供一个新的思路。
　　实验分为在体实验和离体实验两部分。在体实验将30只体重为250 g-300 g之间的SD大鼠随机分为空白对照组、造模组和造模后注射氨基胍组，空白对照组和造模组在第四周后开始腹腔注射生理盐水，氨基胍注射组注射剂量为100 mg/Kg，连续注射14天。断颈处死三组SD大鼠，取右后膝关节软骨组织，提取组织蛋白，测定其蛋白浓度。同时对三组大鼠膝关节软骨组织的iNOs的活力、NO的含量、MMP-3和MMP-13的浓度进行测定。离体实验组培养软骨细胞，并分为空白对照组、IL-1β组、IL-1β+AG和AG作用组，第一组细胞培养液为正常的细胞培养基，第二组细胞培养液中加入10 ng/ml IL-1β，第三组细胞培养液中加入10 ng/ml IL-1β和3 mmol/L(369.36mg/L)AG，第四组细胞培养液中加入3 mmol/L(369.36 mg/L)AG。取软骨细胞并提取蛋白和保留细胞培养液。测量细胞培养液中iNOs的活力和NO的含量。并对四组软骨细胞中MMP-3和MMP-13的浓度进行测定。
　　结果发现在体实验中，造模组的iNOs活力、NO含量、MMP-3和MMP-13的浓度相对于空白对照组显著升高，注射AG后iNOs活力、NO含量、MMP-3和MMP-13的浓度相对于造模组显著降低。离体实验中，被IL-1β刺激后的软骨细胞iNOs活力、NO含量、MMP-3和MMP-13的浓度相对于空白对照组显著升高，经过AG处理过后iNOs活力、NO含量、MMP-3和MMP-13的浓度相对于只被IL-1β处理的软骨细胞显著降低。在细胞培养液中只加入AG组相对于空白对照组没有明显的变化。
　　实验结果表明对于骨关节炎动物模型分泌的诱导型一氧化氮合酶和IL-1β刺激软骨细胞分泌诱导型一氧化氮合酶，氨基胍都能通过抑制诱导型一氧化氮合酶的活性，来降低软骨细胞内NO的含量，间接的降低了MMP-3和MMP-13的浓度，减轻了骨关节炎软骨组织的病理变化。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 骨关节炎

1．1．1 骨关节炎的概述

1．1．2 临床特点

1．1．3 患病因素

1．1．4 发病机理

1．2 大鼠骨关节炎造模

1．3 氨基胍(AG)

1．4 实验的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验仪器及器材

2．1．3 实验试剂与生物耗材

2．1．4 配制主要的试剂

2．2 实验设计

2．2．1 在体实验设计

2．2．2 离体实验设计

2．3 实验方法

2．3．1 大鼠骨关节炎造模

2．3．2 组织切片及苏木精-伊红染色

2．3．3 培养SD大鼠软骨细胞

2．3．4 软骨细胞的鉴定

2．3．5 软骨组织和细胞蛋白的提取与蛋白总浓度的测定

2．3．6 测定指标

2．4 实验数据的分析与统计

3 结果

3．1 动物模型

3．2 造模结果

3．3 在体实验

3．3．1 三组软骨组织中iNOs酶活力的测定

3．3．2 三组软骨组织中NO含量的变化

3．3．3 三组软骨组织中MMP-3浓度的变化

3．3．4 三组软骨组织中MMP-13浓度的变化

3．4 软骨细胞

3．4．1 软骨细胞的培养

3．4．2 软骨细胞的鉴定

3．5 离体实验

3．5．1 离体实验中各组细胞培养液中iNOs活力的变化

3．5．2 离体实验中各组细胞培养液中NO含量的变化

3．5．3 离体实验中各组细胞中所含MMP-3浓度的变化

3．5．4 离体实验中各组细胞中所含MMP-13浓度的变化

4 讨论

4．1 氨基胍对骨关节炎病理变化的影响

4．2 AG对iNOs的影响

4．3 AG对NO的影响

4．4 AG对MMP-3的影响

4．5 AG对MMP-13的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文