Nrf2信号通路在葡萄籽原花青素降低铅诱导的大鼠肾脏氧化应激中的作用

摘要

铅(Lead，Pb)是一种已知的重金属有毒物质，广泛存在于环境中。研究发现，慢性Pb中毒可使肾脏内自由基增加，引起肾脏氧化应激。葡萄籽原花青素(Grape seedproanthocyanidin extract，GSPE)是天然多酚类化合物，具备清除自由基、抗氧化和抗炎等功能。本研究的主要目的是明确GSPE在Pb暴露大鼠肾脏氧化损伤方面的保护作用及核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)信号通路在GSPE保护Pb诱导的肾脏氧化损伤中的作用机制。
　　在本研究中，共选取40只健康雄性wistar大鼠，随机分为四组:对照组、Pb暴露组、解毒组(Pb+GSPE)和GSPE组，每组10只。试验周期为30d，对照组:自由饮水，生理盐水(1 mL/kg·d)灌胃;Pb暴露组:0.25％醋酸铅(lead acetate，PbAc)溶液自由饮用，生理盐水(1 mL/kg·d)灌胃;解毒组(Pb+GSPE):0.25％PbAc溶液自由饮用，GSPE溶液(200mg/kg·d)灌胃;GSPE组:自由饮水，GSPE溶液(200 mg/kg·d)灌胃。
　　在第31d进行采样测定:
　　(1)分别称取大鼠体重和两侧肾脏总质量，计算肾脏脏器指数。
　　(2)大鼠腹主动脉采血，离心取血清，全自动生化分析仪测定血清肌酐（Serum creatinine，SCr）和尿素氮(Bloodurea nitrogen，BUN)水平。
　　(3)火焰原子吸收光谱法测定肾脏中Pb的含量。
　　(4)肾脏组织切片，HE染色，光学显微镜观察组织病理变化。
　　(5)肾脏组织匀浆，应用试剂盒测定肾脏中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、还原性谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和谷胱甘肽s转移酶(Glutathione s-transferase，GST)的水平。
　　(6)原位末端标记法(Terminal Deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick-EndLabeling，TUNEL)测定肾脏中细胞凋亡水平。
　　(7)免疫组化检测肾脏中Nrf2的表达。
　　(8)提取肾脏总蛋白，western blotting测定肾脏中Nrf2、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-likeECH-associated protein1，Keap1)、血红素氧合酶1（Heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1，NQO1）、Bax、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的含量。
　　结果表明:
　　(1)GSPE可以降低Pb暴露大鼠SCr和BUN水平，作用效果达到10％和31％，还可降低Pb中毒引起的脏器指数增加，作用效果达到21％，修复组织损伤。
　　(2)GSPE降低Pb在体内的蓄积，效果可达到33％。
　　(3)GSPE具有清除氧自由基的能力，提高肾组织中GSH、GST和SOD的水平，降低MDA的水平。
　　(4)GSPE可以激活Nrf2信号转导通路，促进肾脏中Nrf2及Ⅱ相解毒酶的表达，降低肾脏氧化损伤及细胞凋亡。
　　上述结果揭示，GSPE对Pb暴露大鼠肾脏具有保护作用，GSPE通过激活Nrf2信号通路，提高Pb暴露大鼠肾脏抗氧化酶活性，降低细胞凋亡，实现对Pb暴露大鼠肾脏的保护作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 铅(Lead，Pb)

1．1．1 Pb与氧化应激

1．1．2 Pb与细胞凋亡

1．1．3 Pb的肾毒性作用

1．1．4 Pb中毒的治疗进展

1．2 葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)

1．2．1 GSPE的抗氧化作用

1．2．2 GSPE的其他作用

1．3 Nrf2信号通路

1．3．1 Nrf2信号通路的组成、功能和激活

1．3．2 Nrf2信号通路的作用

1．4 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 动物处理

2．2．2 样品采集

2．2．3 肾功能的检测

2．2．4 肾脏脏器指数的测定

2．2．5 肾脏中Pb含量的测定

2．2．6 组织病理学观察

2．2．7 肾组织中总蛋白、SOD、MDA、GSH和GST水平的测定

2．2．8 TUNEL法测定肾脏中细胞凋亡水平

2．2．9 肾组织中Nrf2的免疫组化测定

2．2．10 Western blot测定

2．3 数据的统计与分析

3 结果与分析

3．1 大鼠肾损伤指标的变化

3．1．1 大鼠肾脏脏器指数变化

3．1．2 大鼠肾功能指标的变化

3．1．3 大鼠肾脏中Pb含量的变化

3．1．4 大鼠肾组织病理学检测

3．2 大鼠肾脏抗氧化水平的变化

3．3 大鼠肾脏细胞凋亡的检测

3．4 GSPE对Pb暴露大鼠肾脏Nrf2信号通路的影响

3．4．1 大鼠肾脏中Nrf2蛋白含量的变化

3．4．2 大鼠肾脏中HO-1、NQO1和Keap1蛋白含量的变化

4 讨论

4．1 GSPE对Pb暴露大鼠肾损伤的影响

4．2 GSPE对Pb暴露大鼠肾脏抗氧化水平的影响

4．3 GSPE对Pb暴露大鼠肾脏细胞凋亡的影响

4．4 GSPE对Pb暴露大鼠肾脏中的Nrf2信号通路的调节

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文