堆肥中β-glucosidase家族微生物群落与纤维素降解的相关性研究

摘要

实验采用室内小型堆肥反应器以牛粪与稻草为堆肥物料进行为期一个月的高温好氧堆肥。对堆体上、中、下层的温度及环境温度进行测定;对堆肥物料中纤维素、木质素和半纤维素的相对含量进行测定;利用高效液相色谱法(HPLC)测定葡萄糖含量和纤维二糖的含量;测定羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性和β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase)活性;通过构建β-glucosidase GH1、GH3家族基因克隆文库的手段分析堆体中具有β-glucosidase GH1、GH3家族基因功能性微生物的群落组成和优势微生物种属;利用实时荧光定量PCR(q-PCR)判定β-glucosidaseGH1、GH3家族中优势微生物种属在堆肥各个时期的基因拷贝数的变化。通过分析堆肥进程中含β-glucosidase基因功能性微生物群落的演替、优势微生物种属基因拷贝数的变化规律与β-glucosidase活性变化规律的相关性，进一步揭示含β-glucosidase基因功能性微生物的种类与拷贝数的变化规律与纤维素类物质降解的潜在关系。研究结果如下:
　　在堆肥进程中，堆体的平均温度在前3d，快速升温达到45℃即进入高温期，并维持8d后进入降温期最后与环境温度变化趋于一致。纤维素的相对含量在高温期阶段变化明显，半纤维素的相对含量变化趋势与其相似，木质素的相对含量总体上变化不大，且在降温腐熟期有小幅的增加。葡萄糖含量在0-1d呈现下降趋势，在堆肥的第4d葡萄糖含量出现第一个峰值(1.85 mmol/kg)，第4-7 d呈现下降趋势。第23 d葡萄糖的含量达到第二个峰值(5.35mmol/kg)。在第0-4 d，纤维二糖的含量的变化趋势是先升高后降低，在高温阶段的后期和降温腐熟的前期，纤维二糖含量一直处于较低水平，维持在0 mmol/kg-0.91 mmol/kg范围内，与同一时期β-葡萄糖苷水解酶的较高活性相对应。从堆肥的第13d起，纤维二糖大量累积，在第29 d的达到最大值(1.29 mmol/kg)。β-glucosidase活性在第4d达到整个堆肥过程中的最大值(1.482μmol p-Nitr/g dw min)并在降温腐熟期维持在0.429μmol p-Nitr/g dw min-0.533μmol p-Nitr/g dw min范围内;CMC酶活性变化趋势与β-glucosidase活性相似并在第7d达到最大值(47.67μg glucose/g dw min)。
　　在对克隆序列进行比对分析的过程中发现，GH1细菌家族中，k-卡拉胶降解菌属（Devosiasp.）主要在升温期、高温前期和降温腐熟期出现;大豆根瘤菌属（Bradyrhizobium）和微杆菌属（Microbacterium）在各个时期均有出现;根瘤菌属（Rhizobium）在各个时期均有出现，且主要存在于高温前期和高温后期;栖热孢菌属（Thermotoga）等在高温前期出现的次数较多。GH3细菌家族中，寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）在各个时期均有出现，多数存在于升温期中;新月形单胞菌属（Pelosinus）在升温期和高温前期出现的次数较多;分支杆菌属（Mycobacterium）在高温前期、高温后期和降温腐熟期中均有出现。GH3真菌家族中，木霉属（Hypocrea）在升温期、高温前期和降温腐熟期中均有出现，在降温腐熟期出现的次数较多;曲霉属（Aspergillus）各个时期均有出现，在升温期中出现的次数较多;青霉属（Penicillium）主要存在于升温期和降温腐熟期。
　　在对q-PCR获得的β-glucosidase GH1家族通用引物的基因拷贝数的分析中可以发现，升温期和降温腐熟期的基因拷贝数较高温期多。分析8对β-glucosidase GH1家族特异性引物可以发现，GH1-5-2、GH1-3-9、GH1-3-5这三对引物在q-PCR获得的高温期的基因拷贝数明显高于升温期和降温腐熟期，说明Rhizobium和Thermotoga的基因拷贝数在高温期与β-glucosidase的产生和纤维素的降解存在正相关性，即在Rhizobium和Thermotoga对β-glucosidase的产生和纤维素的降解起着主要作用。q-PCR获得GH3细菌家族的4对特异性引物的基因拷贝数在升温期都较高，在高温期基因拷贝数较低。证明Stenotrophomonas、Pelosinus和Mycobacterium均在升温期产生β-glucosidase对纤维素的降解起到一定作用，而在高温期的作用较弱。GH3B-3这对引物在降温腐熟期的基因拷贝数明显高于其他三个时期，可以说明Mycobacterium在降温腐熟期产生β-glucosidase和纤维素的降解过程中起到主要作用。q-PCR获得的β-glucosidase GH3真菌家族通用引物的基因拷贝数在各个时期都处于较高水平，这与真菌是纤维素降解的主要微生物群体有关。同时，分析3对特异性引物获得的基因拷贝数可以发现，3对引物在q-PCR获得的基因拷贝数在各个时期的趋势相同，并可以看出Hypocrea、Aspergillus和Penicillium在升温期和降温腐熟期对β-glucosidase的产生和纤维素的降解起到主要作用，在高温期的作用较弱。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 农业废弃物概述

1．1．1 我国农业废弃物的现况

1．1．2 目前国内外农业废弃物的处理技术

1．1．3 我国农业废弃物资源利用的实际意义

1．2 堆肥概述

1．2．1 堆肥的定义及发展历史

1．2．2 影响好氧堆肥化的主要因素

1．3 堆肥中纤维素的降解

1．3．1 纤维素概述

1．3．2 降解纤维素的微生物

1．3．3 纤维素的降解酶类

1．3．4 β-glucosidase概述

1．4 堆肥微生物学的研究

1．4．1 堆肥微生物降解的基本原理

1．4．2 堆肥过程中微生物的群落及动态

1．4．3 堆肥微生物学的研究方法

1．5 本实验研究思路的提出

1．6 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 堆肥

2．1．2 样品采集

2．1．3 仪器设备与试剂

2．1．4 实验试剂

2．2 试验方法

2．2．1 温度测定

2．2．2 酶活测定

2．2．3 纤维素含量的测定

2．2．4 葡萄糖和纤维二糖含量测定

2．2．5 堆肥中总DNA的提取及纯化

2．2．6 目的基因的扩增

2．2．7 β-glucosidase基因克隆文库

2．2．8 β-glucosidase基因q-PCR

3 结果与分析

3．1 堆肥过程中理化性质的变化

3．1．1 堆肥过程中物理性质的变化

3．1．2 堆肥过程中化学性质的变化

3．2 β-glucosidase基因克隆文库的构建与分析

3．2．1 β-glucosidase GH1家族基因克隆文库的构建与分析

3．2．2 β-glucosidase GH3细菌家族基因克隆文库的构建与分析

3．2．3 β-glucosidase GH3真菌家族基因克隆文库的构建与分析

3．3 堆肥中β-glucosidase基因q-PCR与分析

3．3．1 β-glucosidase GH1家族基因q-PCR与分析

3．3．2 β-glucosidase GH3细菌家族基因q-PCR与分析

3．3．3 β-glucosidase GH3真菌家族基因q-PCR与分析

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文