微创外科技术建立小型猪肾衰竭模型及干预RAAS系统的研究

摘要

近年来小型猪作为比较医学的模型动物受到了越来越多学者的关注，在医学各个领域被广泛应用，由于其与人类的高度同源性，作为模型动物有着不可替代的优势。多年来对于肾衰的动物模型研究局限于鼠或兔等实验动物，与其相比小型猪的体型与结构与人类更为相似且同源性较高，同时与传统手术相比应用微创技术建立模型更大限度的降低了影响因素，然而应用微创外科技术建立小型猪慢性肾衰模型在国内外仍未见报道，建立小型猪的实验用肾衰模型及肾衰模型动物的研究现已成为兽医学及比较医学等领域迫切需要解决的问题。因此，本实验应用腹腔镜技术建立小型猪慢性肾衰模型，并检测肾衰模型的病理及代谢变化，分析RAAS系统（肾素-血管紧张素-醛固酮系统）在肾衰发展中的作用。
　　实验将广西巴马小型猪分为3组，每组5头，共15头小型猪，分别为2/3组、3/4组、5/6组，比较各组间差异，模型建立共需要进行两次腹腔镜下手术。第一次手术2/3组进行腹腔镜下1/3左肾切除术，3/4组进行腹腔镜下1/2左肾切除术，5/6组进行腹腔镜下2/3左肾切除术，通过建立气腹、安置套管、腹腔镜下阻断肾动静脉、按比例切除部分肾组织、开放肾脏动静脉及关闭黢腔等操作步骤完成手术;一周后所有动物进行腹腔镜下右侧全肾切除术。二次手术后进行模型动物的监测，术前、术后3d及每周进行包括体温、心率、血细胞检查、肾功能的检测，以此筛选出最安全、有效、实用的小型猪肾衰模型。
　　筛选出的最佳肾衰模型进行肾脏微环境的观察（RF组），另外选取5头小型猪进行最佳肾衰模型的建立，在二次手术术前、术后3d及术后每周进行新型肾功能标志物(NAGL、CLU、OPN、Kim-1、CysC及β2-微球蛋白)的血液、尿液水平检测，术后2w、4w、6w、8w、10w对模型动物开腹取剩余肾脏组织进行肾功能标志物基因、凋亡基因、转化生长因子TGF-β基因检测以及肾脏病理学检查。
　　应用最佳肾衰模型进行RAAS系统干预实验，选取27头小型猪，共分为3组，每组9头，分别为ACEI组（饲喂卡托普利）、ARB组（饲喂氯沙坦）、SARA组（饲喂螺内酯），其中每组5头在模型建立后术前、术后3d及每周进行包括体温、心率、血细胞检查、肾功能检测、肾功能标志物水平检测;剩余每组4头进行术后开腹取剩余肾脏组织进行肾功能标志物基因、凋亡基因、转化生长因子TGF-β基因检测以及肾脏病理学检查，并与RF组比较差异。
　　本实验首次成功使用腹腔镜技术完成了2/3、3/4、5/6比例的肾脏切除，进行大部分肾脏切除后的小型猪呈现慢性肾衰竭状态，术后到12w之间心率、体温均有不同程度的下降，组间无显著差异;肾功能检测发现术后血肌酐、尿素氮呈持续升高状态，其中肌酐与术前相比在术后2w产生极显著差异(P＜0.01)，而尿素氮在4w开始产生极显著差异(P＜0.01);5/6组肾功能降低速度显著快于其他两组，在5w后显著高于2/3和3/4组(P＜0.05)。不同比例的肾切除建立肾衰模型中，5/6组肾功能持续降低，虽然2/3组和3/4组与其趋势相似，但进展缓慢，没有肾脏功能持续恶化的显著趋势，因此本研究中5/6肾脏切除作为最优的小型猪肾衰模型。
　　在肾衰竭模型的病理学研究中发现肾脏环境主要变化为，在术后2w、4w以肾小管损伤为主要病变，可见肾小管扩张、原有上皮细胞水肿、部分肾组织萎缩、异物多核巨细胞等病变，6w之后则主要以再生、增生为主要病变，可见肾小管再生、新生上皮细胞、炎细胞浸润、纤维组织及胶原增生等，有些可见蛋白管型。肾损伤标志物中CysC、NGAL、OPN和β2-MG反应快、变化幅度大，在术后一周产生极显著差异(P＜0.01)，并且在尿液检测中差异更大;组织中NGALmRNA含量在2w时与术前相比就升高30多倍，CysC mRNA也升高10多倍，其他表达情况与肾损伤情况相同，相比其他检测肾功能指标，CysC和NGAL反应迅速、变化灵敏，在肾损伤早期就发生显著升高，对肾功能的预后发展起到更好的指示作用。
　　在干预小型猪肾衰模型RAAS系统的实验中，ACEI组的小型猪平均8w前死亡，在相同时间点血肌酐、尿素氮、CysC及NGAL的检测中发现与RF组动物相比较高，肾功能降低迅速，加剧了肾衰的进展;而ARB组和SARA组与RF组相比均有良好效果，延缓了肾衰的发展，其中SARA组在6w时血清CysC含量显著低于RF组(P＜0.05)，在7w时血清ALD含量显著低于RF组(P＜0.05)，8w后肌酐尿素氮水平显著低于RF组(P＜0.05)，ARB组的肌酐、尿素氮水平在9w后观察到与RF组的显著差异(P＜0.05)，在9w后ALD与RF组出现显著差异(P＜0.05);在组织学检查中发现ARB和SARA能够延缓纤维增生的进展，抑制了TGF-β的表达。
　　通过本次肾衰模型的建立与研究得出以下结论:
　　1.成功应用腹腔镜技术建立了小型猪肾衰竭模型，具有重复性高，易于复制，术后肾功能逐渐减退的特点。
　　2.通过大部分比例肾脏切除建立小型猪肾衰模型是可行的，相比于5/6肾脏切除，2/3和3/4肾脏切除的小型猪肾衰竭进展缓慢，5/6肾脏切除是最佳的小型猪肾衰模型。
　　3.5/6切除法建立肾衰模型时，6w前主要病理损伤体现为肾小管扩张与坏死，而6w后则体现为明显的纤维性增生和上皮细胞再生。CysC与NGAL与传统肾功能指标相比，反应速度快、灵敏度高，能够更早的提示肾功能变化，与肾功相关性更好，具有更好的诊断意义。
　　4.RAAS系统参与了肾脏损伤过程，肾衰时ALD的表达显著升高;ARB与SARA的应用对肾衰模型起积极治疗及预防的作用，显著地抑制了肾衰时ALD的表达，延缓了肾功能恶化和纤维化的进展;而ACEI的应用加剧了肾衰进展，使肾脏功能迅速恶化。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 腹腔镜技术介绍

1．1．1 腹腔镜外科技术概况

1．1．2 腹腔镜手术特点

1．1．3 腹腔镜的发展状况

1．1．4 腹腔镜手术分类

1．1．5 腹腔镜技术在I隘床中的应用

1．1．6 小型猪在动物模型的应用

1．2 慢性肾功能衰竭介绍

1．2．1 慢性肾功能衰竭特点

1．2．2 肾功能衰竭模型建立方法

1．3 肾功能标志物

1．3．1 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)

1．3．2 血清胱抑素C(CysC)

1．3．3 骨桥蛋白(OPN)

1．3．4 丛生蛋白(CLU)

1．3．5 肾损伤分子(Kim-1)

1．4 RAAS系统及其颉颃剂

1．4．1 RAAS系统

1．4．2 RAAS系统颉颃剂

1．4．3 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)

1．4．4 血管紧张素Ⅱ受体颉颃剂(AI迅)

1．4．5 醛固酮受体颉颃剂(SARA)

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验器材

2．1．3 试验相关药品

2．1．4 试验相关试剂

2．2 方法

2．2．1 慢性肾衰竭模型的研究

2．2．2 小型猪慢性肾衰竭模型肾脏环境的变化

2．2．3 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的研究

2．2．4 数据统计分析方法

3 结果与分析

3．1 腹腔镜下建立小型猪慢性肾衰竭

3．1．1 建立不同比例肾切除的小型猪肾衰竭模型

3．1．2 小型猪不同比例肾切除的生理指标

3．1．3 小型猪不同比例肾切除的血液学结果

3．1．4 小型猪不同比例肾切除的肾脏功能变化

3．2 小型猪慢性肾衰竭模型的肾脏微环境检测

3．2．1 小型猪慢性肾衰竭模型肾脏组织学变化

3．2．2 小型猪慢性肾衰竭模型肾脏功能标志物体液水平检测

3．2．3 小型猪慢性肾衰竭模型肾脏功能标志物基因水平检测

3．2．4 小型猪慢性肾衰竭模型TGF-β基因及蛋白水平表达检测

3．2．5 小型猪5／6肾切除的肝功变化

3．3 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的研究

3．3．1 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的生理指标

3．3．2 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的的血液学结果

3．3．3 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的肾脏功能变化

3．3．4 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的肾脏组织学变化

3．3．5 干预RAAS系统的慢性肾衰竭的肾功标志物变化

3．3．6 干预RAAS系统的慢性肾衰竭TGF-βmRNA表达变化

4 讨论

4．1 肾衰竭模型建立方法研究

4．2 缺血时间对肾功能的影响

4．3 腹腔镜技术在肾脏手术优势

4．4 腹腔镜建立小型猪肾衰模型的注意事项

4．5 腹腔镜建立小型猪肾衰模型的术后损伤状态

4．5．1 血液学检查

4．5．2 病理学检查

4．6 肾损伤标志物在肾衰模型中的表达

4．7 肾衰模型中肾脏再生及凋亡情况

4．8 RAAS系统在慢性肾衰中的作用

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文