大豆7S致敏蛋白‘α-亚基缺失型’近等基因系的近等性评价与应用

摘要

7S球蛋白是大豆种子贮藏蛋白的重要组分也是主要的致敏原。其亚基缺失突变体可以在去除致敏蛋白的同时改善大豆蛋白的营养及加工品质。目前α亚基缺失的等位变异对种子蛋白营养及加工品质的作用及贡献大小尚无充分研究，其分子机制尚未解析。
　　近等基因系(NILs)是理论上可以最大限度排除遗传背景干扰，使单基因效应得以充分表达的理想遗传学材料。本研究首先利用父母本间307个均匀分布于大豆20个连锁群的SSR差异引物对‘α-亚基缺失型’近等基因系候选群体进行全基因组遗传背景扫描，2014年底完成了近等基因系预备群体全面、系统的分子水平的近等性评价，综合严谨、系统的形态相似性评价，完成了一对以中国高油大豆‘东农47’为遗传背景的‘致敏蛋白α-亚基缺失型’单基因近等基因系‘cgy-2-NIL’的创制。‘cgy-2-NIL’的创制，为α-亚基缺失优异等位基因分子水平上的遗传学研究、及其在低致敏大豆分子育种中的应用提供了理想的、永久性遗传学材料平台。
　　目前，α-亚基缺失的等位变异对种子蛋白品质的具体影响及其对缺失体品质改良贡献的大小尚无定论，其分子机制尚未解析。本研究以α单亚基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’为材料，通过对‘cgy-2-NIL’及其轮回亲本‘东农47’进行氨基酸组分、及豆腐加工特性的测定分析，研究α缺失等位基因cgy-2对大豆蛋白营养及豆腐加工品质各项指标的影响及贡献率，以期明确α-亚基缺失等位基因的遗传学效应。
　　RNA-Seq是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术，已被广泛应用于大豆种子发育转录水平的研究。大豆种子发育过程中贮藏蛋白的合成主要受转录水平的调控，转录组水平基础理论数据的获得是透彻解析大豆致敏蛋白亚基缺失突变体遗传机制必不可少的任务之一，为了进一步寻找与α-缺失突变体相关的关键基因，本研究采用RNA-Seq技术，利用α-亚基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’对α-缺失突变体进行五个发育时期（花后18、25、35、50、和55天）转录组差异比较。具体结果如下:
　　(1)经过4代回交，综合SSR标记全基因组遗传背景扫描及严格的形态相似性评价，本研究成功创制了以中国高油大豆‘东农47’为遗传背景的α-亚基缺失型近等基因系(NIL)，将其命名为‘cgy-2-NIL’。‘cgy-2-NIL’仅在第20号染色体上存在α-亚基缺失基因cgy-2的单一导入片段、其综合农艺性状各个指标与其轮回亲本‘东农47’基本一致，利用该近等基因系可以最大限度的降低遗传背景的干扰、精准的分析α-缺失基因的遗传效应、是α-亚基缺失基因精细定位，图位克隆及相关基因功能验证研究理想的遗传学材料平台。
　　(2)近等基因系‘cgy-2-NIL’的粗蛋白含量，氨基酸总量，必须氨基酸总量，含硫氨基酸含量（蛋氨酸+半胱氨酸）分别比轮回亲本‘东农47’高出4.11，4.16，5.20和11.96个百分点。‘cgy-2-NIL’中必须氨基酸组分:苏氨酸(Thr)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，异亮氨酸(Ile)含量的显著增加导致其必须氨基酸总量明显高于对照‘东农47’。‘cgy-2-NIL’蛋氨酸含量的显著增加是导致其含硫氨基酸总量(Met+Cys)显著高于‘东农47’的主要原因。
　　(3)成熟种子‘cgy-2-NIL’游离精氨酸的含量是‘东农47’的两倍。‘cgy-2-NIL’中，游离精氨酸含量占其游离氨基酸总量的36.81％，游离天门冬氨酸(Free Asp)和游离谷氨酸(Free Glu)分别占11.63％和9.32％，其余的游离氨基酸组分占‘cgy-2-NIL’游离氨基酸总量的42.24％。游离精氨酸含量的大幅增加是‘cgy-2-NIL’游离氨基酸总量显著高于对照‘东农47’的主要原因。
　　(4)近等基因系‘cgy-2-NIL’TEAA及EAAI的得分都显著高于‘东农47’。可见，致敏蛋白α亚基缺失，在降低致敏率的同时，可以提高氨基酸总量，改善氨基酸品质。
　　(5)通过RNA-Seq测序，在‘cgy-2-NIL’与‘东农47’两材料间，共检测到20，295个表达有显著差异的基因。其中花后18、25、35、50及55天时，‘cgy-2-NIL’与‘东农47’间表达有显著差异的基因数分别是174、151、123、158和2837个。本研究所检测到的差异基因几乎都具有发育时期差异表达特异性，在花后55天时二者间显著差异表达的基因数目最多，只有17个基因在五个发育时期内全部差异表达;‘显著差异表达排名前20的基因’主要集中在花后18天及花后55天，花后18天差异表达的基因，可以认定为是决定α-缺失特性的关键基因，开花后55天差异表达的各个基因，则可以认定为是突变体应对蛋白组分改变、保持蛋白品质的关键基因。
　　(6) Gene Ontology(GO)分析结果表明，花后18、35、55天差异基因GO分类的结果大体类似，但花后25及50天时差异基因GO富集的分类特点截然不同。在18、25、35、50和55天，‘cgy-2-NIL’与‘东农47’之间分别鉴定出16条、3条、9条、4条和12条pathway。特别值得关注的是花后18天时，检测到多个差异表达基因被富集在氨基酸代谢途径及脂肪酸代谢途径中。
　　(7)五个发育期，共鉴定到74个转录因子基因在α-亚基缺失突变体‘cgy-2-NIL’内发生差异表达，其中GRAS转录因子家族中的差异表达基因数目最多。多数转录因子基因在花后55天时差异表达，花后50天时检测到的差异表达的转录因子最少。13个MADS-box转录因子在花后55天时全部下调表达。
　　(8)‘cgy-2-NIL’中，有18个差异表达基因被注释为编码Cupin过敏蛋白，α-亚基缺失导致突变体内几乎所有7S球蛋白亚基（α'、α、β-亚基）与11S球蛋白亚基(Gy1-、Gy2-、Gy3-、Gy4-、Gy5-亚基)基因在多数发育期内均呈现下调表达趋势。G1YMA20G28660（即α-亚基基因）是所有差异表达基因中，在花后25、35、和50天时均显著下调表达的基因，α-亚基缺失突变体‘cgy-2-NIL’11S球蛋白Gy3与Gy7亚基基因的表达模式与Gy1-Gy5亚基不同。突变体‘cgy-2-NIL’内7S与11S球蛋白Cupin过敏蛋白家族基因的协同下调表达，是α-亚基缺失突变体致敏性降低的主要原因。
　　(9)为验证测序结果的准确性，选取分别在五个发育时期差异表达的六个基因，在大豆籽粒发育的18、25、35、50和55天进行实时荧光定量PCR分析，检测结果与RNA-Seq测序结果相符，证明RNA-Seq测序结果准确可靠。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．1 低致敏大豆是低抗原大豆蛋白制品最经济、安全的原材料

1．1．2 国内外低／无致敏大豆品种的研究进展

1．1．3 大豆7S致敏蛋白α-亚基缺失型低致敏大豆的研究

1．2 大豆作图群体在蛋白质组分改良中的作用

1．2．1 大豆染色体代换系群体的研究进展

1．2．2 近等基因系(NILs)在大豆蛋白质组分改良中的应用

1．3 大豆转录组学研究进展

1．3．2 RNA-Seq在大豆分子生物学中的应用

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1．2 SSR标记全基因组遗传背景选择

2．1．3 SDS-PAGE分析及Western杂交确认亚基组成

2．1．4 田间农艺性状调查及室内考种

2．1．5 品质分析

2．1．6 统计学分析

2．2．4 大豆种子发育过程中17种游离氨基酸组分、含量分析

2．2．5 豆腐加工特性

2．2．6 统计分析方法

2．3 ‘cgy-2-NIL’及其轮回亲本种子不同发育时期基因表达谱的差异比较

2．3．1 植物材料的采集及预处理

2．3．2 籽粒发育各时期的比较转录组学分析

2．3．3 生物信息学分析

2．3．4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)对表达谱测序结果的验证

3 结果与分析

3．1．1 致敏蛋白α-亚基缺失型近等基因系(NILs)的构建

3．1．2 候选群体的近等性评价

3．1．3 近等性常规评价结果(综合农艺性状考察)

3．1．4 ‘cgy-2-NIL’α-亚基缺失特性的SDS-PAGE及Western杂交分析

3．2 α-亚基缺失基因cgy-2对大豆营养及加工品质的影响

3．2．1 α-亚基缺失基因cgy-2等位变异对大豆种子氨基酸组分及含量的影响

3．2．2 ‘cgy-2-NIL’种子发育过程中游离氨基酸积累模式的分析

3．2．3 α-亚基缺失基因cgy-2对大豆种子豆腐加工品质的影响

3．3 ‘cgy-2-NIL’及其轮回亲本种子不同发育时期基因表达谱的差异比较

3．3．1 测序时期的选择

3．3．2 RNA-Seq基因表达谱的生物信息学结果分析

3．3．3 差异基因的Gene Ontology (GO)功能显著性富集分析

3．3．4 差异基因的Pathway功能显著性富集及通路分析

3．3．5 α-亚基缺失对转录因子(Transcription Factor，TF)基因表达的影响

3．3．6 α-亚基缺失对Cupin过敏蛋白家族基因表达的影响

3．3．7 实时荧光定量PCR验证RNA-Seq测序结果

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士期间发表学术论文