噻拉嗪对大鼠脑神经系统CaMK/CREB/BDNF信号通路影响的研究

摘要

噻拉嗪作为多种复合麻醉剂的重要组成成分之一，研究其麻醉的作用机理对研究高效、副作用低的复合麻醉剂十分重要，目前，对噻拉嗪麻醉作用的神经信号通路的研究较少。本实验从分子水平对噻拉嗪的麻醉机制进行探讨，为今后的临床麻醉提供合理的分子理论依据。 实验以成年Wister大鼠和PC12神经细胞为研究对象，体内实验腹腔注射70 mg/kg噻拉嗪，通过连续观察大鼠行为学变化确定实验分组，进一步检测大鼠不同脑区在不同麻醉时期的指标变化，采用RT-PCR方法检测NR1、NR2A、NR2B、CaMKⅡ、CaMKⅣ、CREB、BDNF、c-jun、c-fos和fos-b的mRNA表达，Western Blot方法检测NR1、NR2A、NR2B、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaMKⅣ、p-CaMKⅣ、CREB、p-CREB和BDNF的蛋白表达;体外细胞实验通过在培育的PC12神经细胞中加入噻拉嗪，并且通过siRNA技术对CaMKⅡ和CaMKⅣ进行靶向沉默，探究CaMKⅡ和CaMKⅣ对下游CREB/BDNF通路以及IEGs(c-jun、c-fos和fos-b)的影响，采用RT-PCR方法检测CaMKⅡ、CaMKⅣ、CREB、BDNF、c-jun、c-fos和fos-b的mRNA表达，Western Blot方法检测CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaMKⅣ、p-CaMKⅣ、CREB、p-CREB和BDNF的蛋白表达。 实验发现: 1.NR1蛋白表达在小脑、海马和丘脑中有降低趋势，而在脑干中其有升高趋势，NR1mRNA表达在五个脑区较对照组无变化;NR2A蛋白表达在大脑、小脑、海马和丘脑中有降低趋势，NR2A mRNA表达仅在大脑有降低趋势;NR2B在五个脑区均有降低趋势，NR2BmRNA表达仅在大脑有降低趋势。 2.CaMKⅡ蛋白表达在小脑、丘脑和脑干中有降低趋势，CaMKⅡ mRNA表达仅在脑干中有降低趋势，p-CaMKⅡ蛋白表达在五个脑区均有降低趋势;CaMKⅣ蛋白表达在五个脑区均有降低趋势，CaMKⅣ mRNA表达在丘脑和脑干中有降低趋势，p-CaMKⅣ蛋白表达在五个脑区均有降低趋势。 3.CREB蛋白表达在小脑、海马、丘脑和脑干中有降低趋势，CREB mRNA表达在丘脑和脑干中有降低趋势，p-CREB蛋白表达在五个脑区均有降低趋势;BDNF蛋白表达在五个脑区均有降低趋势，BDNF mRNA表达在五个脑区均有降低趋势;c-jun、c-fos和fos-b mRNA表达在五个脑区均有降低趋势。 4.噻拉嗪明显抑制了PC12神经细胞中CaMKⅡ、CaMKⅣ、CREB、BDNF、c-jun、c-fos和fos-b mRNA表达，以及CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CaMKⅣ、p-CaMKⅣ、CREB、p-CREB和BDNF的蛋白表达;通过siRNA-CaMKⅡ处理的细胞CaMKⅡ、CREB、BDNF、c-jun、c-fos和fos-b mRNA表达明显降低，以及CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB、p-CREB和BDNF的蛋白表达明显降低;通过siRNA-C MKⅣ处理的细胞CaMKⅣ、CREB、BDNF、c-jun、c-fos和fos-b mRNA表达明显降低，以及CaMKⅡ、CaMKⅣ、p-CaMKⅣ、CREB和BDNF的蛋白表达明显降低。 研究结果表明噻拉嗪对大鼠麻醉是通过影响以上相关因子的表达以及它们之间的级联反应造成的，以及通过抑制CaMKⅡ、CaMKⅣ/CREB/BDNF通路对大鼠产生麻醉效果。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 噻拉嗪概述

1．1．1 噻拉嗪的作用机制

1．1．2 噻拉嗪麻醉剂的应用现状

1．2 谷氨酸能信号转导系统的相关研究

1．3 CaMKⅡ、CaMKⅣ／CREB／BDNF通路的相关研究

1．3．1 CaMKⅡ、CaMKⅣ／CREB／BDNF通路的概述

1．3．2 CaMKⅡ和CaMKⅣ的相关研究

1．3．3 CREB的相关研究

1．3．4 脑源性神经营养因子BDNF的相关研究

1．4 即刻早期基因(IEGs)的相关研究

1．5 实验目的及意义

2 材料方法

2．1 实验动物

2．2 实验仪器与试剂

2．3 噻拉嗪麻醉剂量的确定

2．4 实验动物分组

2．5 各脑区组织样品的收集

2．6 细胞培养和处理

2．8 CCK-8的检测

2．9 细胞转染

2．10 RT-PCR方法检测相关通路基因表达

2．11 Western Blot方法检测相关通路蛋白表达

2．12 数据统计分析

3 结果

3．1 噻拉嗪麻醉剂量的确定

3．2 噻拉嗪加入PC12细胞剂量的确定

3．3 噻拉嗪对大鼠不同脑区相关通路基因表达的影响

3．3．1 噻拉嗪对大鼠大脑相关通路基因表达的影响

3．3．2 噻拉嗪对大鼠小脑相关通路基因表达的影响

3．3．3 噻拉嗪对大鼠海马相关通路基因表达的影响

3．3．4 噻拉嗪对大鼠丘脑相关通路基因表达的影响

3．3．5 噻拉嗪对大鼠脑干相关通路基因表达的影响

3．4 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区相关通路蛋白表达的影响

3．4．1 噻拉嗪麻醉对大鼠大脑相关通路蛋白表达的影响

3．4．2 噻拉嗪麻醉对大鼠小脑相关通路蛋白表达的影响

3．4．3 噻拉嗪麻醉对大鼠海马相关通路蛋白表达的影响

3．4．4 噻拉嗪麻醉对大鼠丘脑相关通路蛋白表达的影响

3．4．5 噻拉嗪麻醉对大鼠脑干相关通路蛋白表达的影响

3．5 噻拉嗪对PC12神经细胞相关通路基因表达的影响

3．6 噻拉嗪对PC12神经细胞相关通路蛋白表达的影响

4 讨论

4．2 噻拉嗪麻醉对CaMKⅡ、CzMKⅣ／CREB／BDNF信号通路相关指标的影响

4．2．1 噻拉嗪麻醉对蛋白激酶CaMKⅡ和CaMKⅣ的影响

4．2．2 噻拉嗪麻醉对CREB的影响

4．2．3 噻拉嗪麻醉对BDNF的影响

4．3 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区即刻早期基因(IEGs)的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文