噻拉嗪对大鼠脑神经系统PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路影响的研究

摘要

本试验以雄性Wistar大鼠为研究对象，给予噻拉嗪麻醉，通过测定大鼠不同脑区不同麻醉时期的PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路中的相关蛋白及基因表达的变化，探讨噻拉嗪麻醉的作用机理。 试验选取35只雄性Wistar大鼠，分成对照组(C)和麻醉组(X)，麻醉组又被随机分为6组(n=5):诱导组(X1)、翻正反射消失0 min组(X2)、翻正反射消失30 min组(X3)、翻正反射消失60 min组(X4)、翻正反射恢复0 min组(X5)和翻正反射恢复30 min组(X6)。对照组大鼠在注射生理盐水8 min后，麻醉组在注射噻拉嗪（70 mg/kg）各个时间点之后，立即断头处死大鼠并取脑组织，利用RT-PCR方法检测GluR1、GluR2、ERK1/2、PKC、PKA、CREB、c-jun、c-fos、fos-B和BDNF的mRNA表达;Western blot方法检测GluR1、GluR2、ERK1/2/p-ERK1/2、PKA/p-PKA、PKC/p-PKC、CREB/p-CREB和BDNF的蛋白表达。利用ATP酶试剂盒测定ATP酶的活性，通过ELISA试剂盒测定cAMP的含量。通过这些指标的变化分析，探讨噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区及神经元所产生的影响与PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路的关系。 试验结果如下: (1)组织实时定量PCR试验结果显示，与对照组比较，GluR1在大脑和海马中显著下降;GluR2和ERK1/2在大脑中显著下降;PKC在各脑区均无明显变化;PKA在海马和丘脑中下降明显;CREB在丘脑和脑干中下降明显。c-jun、fos-B、c-fos和BDNF在各脑区均有明显下降(P＜0.05)。 (2)细胞实时定量PCR试验结果显示，ERK1/2的mRNA表达量:K组、ERK1/2i组与C组比较差异显著(P＜0.05)。PKA的mRNA表达量:K组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。CREB的mRNA表达量:各组与C组比较均无明显的差异（P＞0.05）。c-jun、c-fos、fos-B、BDNF的mRNA表达量:K组、ERK1/2i组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。 (3)组织Western blot试验结果显示，与C组比较，p-CREB、GluR1、p-ERK1/2和p-PKA在各脑区内均有明显变化（P＜0.05）;CREB在小脑、海马、丘脑和脑干下降明显(P＜0.05);GluR2在大脑、丘脑和脑干中下降明显，GluR2在小脑中显著升高;ERK1/2在大脑、小脑和脑干中下降明显;PKA在海马和丘脑中下降明显;PKC和p-PKC在各脑区内均无明显的变化;BDNF在各脑区均有明显下降（P＜0.05）。 (4)细胞Western blot试验结果显示，ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达量:K组、ERK1/2i组与C组比较差异显著（P＜0.05）。PKA、CREB、p-CREB、BDNF的蛋白表达量:K组、ERK1/2i组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。p-PKA的蛋白表达量:K组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。 (5) Na+-K+-ATPase活性在大脑、海马、丘脑和脑干内明显下降（P＜0.05）。 (6) Ca2+-Mg2+-ATPase活性在五个脑区内均明显下降（P＜0.05）。 (7) cAMP的含量在五个脑区内均明显下降(P＜0.05)。结果表明: (1)噻拉嗪通过影响神经系统AMPA膜受体、CREB蛋白通路和c-fos、 fos-B、c-jun和BDNF基因转录，使机体处于麻醉状态。 (2) ERK1/2和PKA能够调节CREB的表达量，并且影响CREB下游指标，表明噻拉嗪是通过抑制CREB通路对大鼠产生麻醉效果。 (3)在大鼠大脑、小脑和海马内ERK1/2/p-ERK1/2、PKA/p-PKA、CREB/p-CREB、c-jun、c-fos、fos-B和BDNF指标变化明显，表明噻拉嗪对大鼠麻醉是通过影响以上相关因子的表达以及它们之间的级联反应达到麻醉效果的。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 噻拉嗪的概述

1．1．1 噻拉嗪的镇静、镇痛作用

1．1．2 噻拉嗪的麻醉作用

1．1．3 噻拉嗪复合麻醉剂的应用

1．2 动物全身麻醉

1．2．1 全身麻醉概念

1．2．2 全身麻醉的研究进展

1．2．3 全身麻醉对神经系统的作用

1．2．4 全麻药与相关信号通路的关系

1．3 CREB信号通路与麻醉

1．3．1 GluR1、GluR2与麻醉的关系

1．3．2 ATP酶与麻醉的关系

1．3．3 cAMP与麻醉的关系

1．3．4 ERK1／2与麻醉的关系

1．3．5 PKC与麻醉的关系

1．3．6 PKA与麻醉的关系

1．3．7 CREB与麻醉的关系

1．3．8 c-fos、c-jun和fos-B与麻醉的关系

1．3．9 BDNF与麻醉的关系

1．4 试验目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．2 试验仪器设备

2．1．3 试验试剂和药品

2．2 试验方法

2．2．1 试验技术路线图

2．2．2 噻拉嗪麻醉剂量的确定

2．2．3 试验动物分组

2．2．4 脑组织采集

2．2．6 细胞中噻拉嗪给药剂量的测定

2．2．7 细胞转染

2．2．8 ATP酶活性检测

2．2．9 cAMP含量的测定

2．2．10 实时定量PCR

2．2．11 蛋白免疫印迹技术

2．2．12 数据分析统计

3 结果

3．1 噻拉嗪麻醉大鼠最佳剂量的筛选

3．2 细胞中噻拉嗪给药剂量的筛选

3．3 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区内ATP酶活性的影响

3．3．2 对大鼠不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

3．4 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区内cAMP含量的影响

3．5 噻拉嗪对大鼠同脑区基因表不达的影响

3．5．1 对大脑内基因表达水平的影响

3．5．2 对小脑内基因表达水平的影响

3．5．3 对海马内基因表达水平的影响

3．5．4 对丘脑内基因表达水平的影响

3．5．5 对脑干内基因表达水平的影响

3．6 对PC12细胞内基因表达水平的影响

3．7 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区内蛋白表达的影响

3．7．1 对大脑内蛋白表达水平的影响

3．7．2 对小脑内蛋白表达水平的影响

3．7．3 对海马内蛋白表达水平的影响

3．7．4 对丘脑内蛋白表达水平的影响

3．7．5 对脑干内蛋白表达水平的影响

3．8 对PC12细胞内相关蛋白表达的影响

4 讨论

4．1 噻拉嗪麻醉对ATP酶活性的影响

4．1．2 对大鼠不同脑区内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

4．2 噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区内cAMP含量的影响

4．3 噻拉嗪麻醉对相关信号通路的影响

4．3．2 对ERK1／2的影响

4．3．3 对PKA的影响

4．3．4 对PKC的影响

4．3．5 对CREB的影响

4．3．6 对c-jun、c-fos和fos-B的影响

4．3．7 对BDNF的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文