晚期胚胎富集蛋白基因植物表达载体的构建及其功能验证

摘要

本研究是将从抗旱、耐盐植物柽柳(Tamarix.sp)中克隆得到的LEA基因构建到植物表达载体pROKⅡ上，并对烟草进行遗传转化，验证LEA基因的功能。实验中共获得84株卡那霉素抗性芽，转化率达到34％。经选择再分化实验，选择出长势及卡那霉素抗性最优的24个无菌株系，经PCR检测均为阳性。从24个最优株系中随机选择了10个株系进行了Southern印迹杂交，证明LEA基因已整合到烟草基因组中。通过RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR分析证实，转入的外源基因能够表达，但10个转基因株系外源基因的表达水平不尽相同，相对于内标基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶)的表达水平在15.52～115.49之间。 对10个转基因株系进行了干旱胁迫试验，测定并分析了胁迫前后过氧化物酶(peroxidase，POD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和相对电导率的变化，比较并分析了旱胁迫后各转基因株系的相对生长量和旱害情况的差异，证实了来源于柽柳的LEA基因具有提高植物耐旱性的功能。在干旱胁迫处理后，各转基因株系与非转基因对照株系POD活性均呈上升趋势。但是，各转基因株系POD活性明显高于非转基因对照株系的POD活性，其中TL15和TL10表现最优，POD活性较非转基因对照株系分别高68.1％和61.0％。转基因株系中POD活性最低的TL19也较对照高18.0％。各株系MDA含量在干旱胁迫后也呈上升趋势，但各转基因株系MDA含量明显低于非转基因对照株系。经多重比较，转基因株系中TL8、TL15和TL16的MDA含量与非转基因对照株系的MDA含量差异达到极限著水平，三者MDA含量分别低于对照46.2％、46.3％和43.3％。与MDA含量测定结果相同，胁迫后各株系相对电导率也呈上升趋势，但各转基因株系相对电导率明显低于非转基因对照株系的相对电导率。经多重比较，除TL22之外的各转基因株系均与对照呈极显著差异，其中TL8、TL15和TL16表现最优，三者相对电导率分别低于对照38.3％、36.6％和37.3％。各转基因株系相对生长量在205.0％～341.1％范围之间，均高于对照株系的相对生长量——170.3％。相对生长量最大的为TL8、TL15和TL16，较对照高91.3、98.8％和100.3％，这与相对电导率和MDA含量分析结果相一致。在相同旱胁迫条件下，各转基因株系的旱害指数均较非转基因对照株系低。对照株系的旱害指数在旱胁迫后达到56.9％；转基因株系中，旱害指数最高的为TL10，达到43.8％，最低的为TL15，旱害指数为28.1％。 通过以上各项实验的结果说明，转入的LEA基因在植株受到干旱胁迫时对植物组织和细胞能够起到保护作用，证实了来源于柽柳的LEA基因具有提高植物旱胁迫耐受能力的功能。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1干旱胁迫对植物的影响

1.1.1干旱胁迫对植物生长发育的影响

1.1.2干旱胁迫对植物细胞结构的影响

1.1.3干旱胁迫对植物生理过程的影响

1.2植物晚期胚胎富集蛋白研究进展

1.2.1 LEA蛋白的存在和性质

1.2.2 LEA蛋白的分类

1.2.3 LEA蛋白的结构与功能

1.2.4 LEA基因的表达调控

1.2.5利用转基因植物评价LEA基因功能

1.3本项研究的目的和意义

2 LEA基因植物表达载体的构建

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2酶和试剂

2.2实验方法

2.2.1 LEA基因植物表达载体的构建

2.2.2中间表达载体导入农杆菌EHA105

2.3结果与分析

2.3.1目的基因的扩增及扩增产物的双酶切

2.3.2 pROKⅡ的双酶切

2.3.3中间表达载体pLR的鉴定

2.3.4三亲交配转化质粒的PCR扩增

3根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2培养基

3.1.3主要生化试剂

3.2实验方法

3.2.1无菌苗的继代培养

3.2.2抗生素浓度的确定

3.2.3根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化

3.3结果与分析

3.3.1选择抗生素浓度的确定

3.3.2抑菌抗生素最佳浓度的确定

3.3.3 LEA基因的高效遗传转化体系

4转基因烟草的分子检测

4.1主要试剂

4.1.1 DNA提取试剂

4.1.2杂交检测试剂

4.1.3总RNA提取试剂

4.1.4酶类及试剂盒

4.2实验方法

4.2.1转化烟草的PCR检测

4.2.2探针的制备

4.2.3 Southern印迹杂交

4.2.4 RT-PCR检测

4.2.5实时荧光定量RT-PCR检测

4.3结果与分析

4.3.1转化烟草的PCR检测

4.3.2转化烟草的Southern印迹杂交

4.3.3转基因烟草总RNA的提取和纯化

4.3.4高质量cDNA的获得

4.3.5 RT-PCR检测

4.3.6实时荧光定量RT-PCR检测

5 LEA基因的功能验证

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2试剂

5.2实验方法

5.2.1超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

5.2.2过氧化物酶(POD)活性测定

5.2.3丙二醛(MDA)含量测定

5.2.4相对电导率测定

5.2.5苗高和旱害指数的比较

5.2.6抗旱能力与外源基因表达量的相关性分析

5.3结果与分析

5.3.1转LEA基因烟草SOD活性比较

5.3.2转LEA基因烟草POD活性比较

5.3.3转LEA基因烟草MDA含量的比较

5.3.4转LEA基因烟草质膜相对透性比较

5.3.5转LEA基因烟草相对生长量比较

5.3.6转LEA基因烟草旱害情况比较

5.3.7转LEA基因烟草的抗旱能力与外源基因表达量的相关性分析

6讨论

6.1转LEA基因烟草的检测

6.2 PEG模拟干旱胁迫研究转基因烟草生理的可行性

6.3水分胁迫对抗氧化系统的影响

6.4水分胁迫对脂质过氧化作用的影响

6.5水分胁迫对质膜相对透性的影响

6.6转LEA基因烟草中存在转录后基因沉默的可能性分析

6.7 LEA基因功能评价

6.8问题和展望

7 结论

参考文献

附录LEA基因植物表达载体的构建流程

图版

攻读学位期间发表的学术论文

致谢