盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠海马CA1区BDNF、NGF、ERK表达的影响

摘要

背景和目的
　　 血管性痴呆(Vascular dementia，VaD)是一种异质综合症，具有各种不同的症状群。凡与血管性因素有关的痴呆，都可以称之为血管性痴呆。临床上血管性痴呆主要是指由于各种类型的缺血性脑血管疾病导致脑组织损伤引起的获得性智能损害和认知障碍的综合征，为一类慢性进行性疾病，其中认知障碍是VaD的核心症状。血管性痴呆是继阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)之后第二位最常见的痴呆原因[1]，约占所有痴呆的10％-50％。随着未来人口平均寿命的增加和社会人口的老龄化，脑血管疾病日益增多，VaD的发病率有逐渐上升的趋势，严重影响患者的生活质量，也给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。因此对VaD的研究引起全世界各国的普遍重视，是一个相当有实用价值的课题。
　　 多个体内外研究证实，盐酸美金刚有神经保护作用，分别于2002年和2003年被欧洲CPMP和美国FDA批准用于治疗中、重度AD[2]，Kavirajan[3]等进行的一项系统评价和汇总分析也证实了其对血管性痴呆的疗效以及较好的安全性和耐受性。美金刚改善痴呆患者的认知功能的确切机制尚不完全清楚，目前的研究集中在盐酸美金刚为中等亲和力、非竞争性、电压依赖性N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体阻断剂。
　　 脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是机体内两种重要的神经营养因子。研究发现脑缺血后脑内神经营养因子表达增加，可以起到保护受损脑细胞及促进神经细胞功能恢复的作用。
　　 细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，p-ERK是其活性形式。ERK的底物包括细胞内其他重要的激酶、转录因子、组蛋白以及K+通道等，这些物质是细胞内的重要组成成分，在学习记忆形成过程中必不可少，同时ERK可能参与了神经元形态学可塑性的形成过程[5]。
　　 本课题通过建立血管性痴呆的大鼠模型，观察大鼠的学习记忆能力，海马神经元的形态学变化及海马神经元BDNF、NGF和ERK表达，探讨盐酸美金刚治疗血管性痴呆的机制和它的神经保护机制。
　　 材料与方法
　　 1动物及分组
　　 健康雄性Wistar大鼠48只(河南省医学动物实验中心提供)，14～15月龄，体重(400±50)g，随机分为假手术组、VD组和盐酸美金刚治疗组，每组16只。
　　 2模型制备及药物干预
　　 采用双侧颈总动脉(CCA)永久结扎法制备模型，盐酸美金刚组给予盐酸美金刚3mg/kg(溶解于生理盐水中)灌胃，每日1次，共6w；假手术组和VD组给予相同剂量的生理盐水灌胃，每日1次，共6w。
　　 3学习记忆能力测定
　　 灌胃结束后用Y-型迷宫测试学习能力，以连续10次测试中有9次正确反应即为达到学会标准，记录动物达到标准所需电击的次数，以此作为学习能力的指标。24h后，重复以上实验过程，观察大鼠的记忆能力。
　　 4标本制备
　　 学习记忆能力测试完毕后，将大鼠处死制作脑组织切片，HE染色观察形态学变化，采用SP免疫组化法检测BDNF、NGF、ERK的表达。
　　 5免疫组化染色的结果判定
　　 免疫阳性细胞被染成棕褐色，BDNF、NGF、ERK都是胞浆着色，采用Qwin550CW图像处理与分析系统，测定阳性反应物质的平均灰度值。
　　 6统计学分析
　　 所有实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析法，使用SPSS13.0统计软件，用S-N-K法进行各组间的两两比较。检验水准取a=0.05。
　　 结果：
　　 1学习记忆成绩 VD组大鼠达标时所需电击次数最多(学习成绩9.63+4.18次，记忆成绩69.81±3.94次)，盐酸美金刚组居中(学习成绩61.94±3.62次，记忆成绩49.94±3.96次)，而假手术组最少(学习成绩47.69±3.05次，记忆成绩38.44±2.66次)，三组间的成绩有显著性差异，P<0.05。
　　 2 HE染色假手术组海马CA1区神经元排列规则致密，细胞核大而园，核仁清晰；VD组海马神经元结构紊乱，排列疏松，细胞核固缩，深染；盐酸美金刚组排列较紧密，细胞核圆，核仁清晰，仅见少量固缩变性的神经元。
　　 3免疫组化结果光镜下观察BDNF、NGF、ERK阳性细胞呈胞浆棕褐色细颗粒状着色。假手术组见少量弱染及中等强度染色的BDNF、NGF阳性神经元；模型组层次减少，排列疏松，但残余的BDNF、NGF阳性神经元胞浆内着色明显加重，呈棕褐色，并可见胞核着色；盐酸美金刚组BDNF、NGF阳性神经元数大量增加。假手术组海马CA1区有大量的ERK免疫反应阳性神经元，呈棕褐色，胞体较大，圆形或椭圆形；而模型组阳性神经元数目明显减少，胞体变小，核固缩；盐酸美金刚组可见阳性神经元数目较模型组增多，胞体变大。BDNF的阳性区平均灰度值依次为：109.94±4.82，137.78±6.46，174.12±6.90，F=510.439，P<0.05；NGF的阳性区平均灰度值依次为：106.17±5.53，130.65±5.07，165.95±6.14，F=461.602，P<0.05：ERK的阳性区平均灰度值依次为：164.05±6.62，99.50±7.28，131.24±7.32，F=332.431，P<0.05。
　　 结论：
　　 1、盐酸美金刚能减少血管性痴呆大鼠海马神经元的缺血坏死，减轻脑组织的不可逆损害，具有神经保护作用，还可以改善其学习记忆能力。
　　 2、BDNF、NGF的表达增高及ERK表达的降低参与了血管性痴呆的发生发展过程。
　　 3、盐酸美金刚可能通过提高内源性BDNF、NGF表达，起到神经保护作用，增加ERK表达改善血管性痴呆学习记忆能力。

目录

文摘

英文文摘

前 言

材料方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

综述部分

参考文献

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致谢