食管癌中miR-149参与调控DNA聚合酶β的表达

摘要

目的： 食管癌（esophageal cancer，EC）在全球癌症中发病率和死亡率都极高，严重威胁着人类的健康。其中，在中国食管癌也是最严重的恶性肿瘤之一。食管癌病情发展迅速，患者一般在发现时就已经恶化或处于淋巴结转移的状态。虽然食管癌的诊断和治疗有很大的进展，但采取积极治疗后总体生存率仍然较低。因此，研究食管癌的发生和进展机制，对其诊断方法尤为重要。 微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是由18-24个核苷酸组成的一类保守、小型非编码调控RNA，其与靶基因mRNA的3’端非编码区（3’UTR）特异性结合，在转录和翻译水平调节其基因的表达。研究发现miRNAs在细胞分化、凋亡、增殖和代谢等生物学和病理过程中起作用，通常作为癌基因或肿瘤抑制因子在癌症发病机制中具有潜在的作用。大量研究发现miRNAs在食管癌组织中显示出差异表达，因此已被作为预后标志物进行研究，此外识别它们的靶基因并理解它们的作用模式越来越引起人们的兴趣。 DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是哺乳动物细胞核中大量存在的一种修复酶，参与DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)的关键酶，在碱基切除修复、DNA复制和DNA合成中起着重要作用。DNA polβ在肿瘤发生和肿瘤进展中发挥着关键作用，并显示出作为治疗靶点的潜力。 本实验室先前的食管癌及其配对癌旁组织基因芯片分析发现，miR-149存在差异性表达，生物信息学分析发现miR-149和DNA polβ存在结合位点。本研究拟进一步探索miR-149和DNA polβ之间的靶向关系，对食管癌的发生和发展机制有更深入的了解，以利于该疾病的诊断和治疗。 方法： 1.从2014年到2015年在郑州大学第一附属医院和林州市肿瘤医院共收集64例食管癌患者手术切除的癌组织和其配对癌旁组织标本，保存在液氮中备用。 2.用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法检测64例食管癌患者癌组织及其配对癌旁组织标本中miR-149和polβ表达水平。 3.运用Pearson相关性分析，分析食管癌患者癌组织及其配对癌旁组织标本中miR-149和polβ表达水平的相关性。 4.利用生物信息学分析软件分析与miR-149存在互补结合的区域，预测其靶基因。 5.合成miR-149mimics和miR-149NC（negative control），利用脂质体将其转染进食管癌EC9706细胞中，将实验分为三组：miR-149组（转染miR-149mimics）、NC组（转染miR-149NC）和Blank组（仅加入脂质体）。 6.用Western blot实验检测转染后EC9706细胞中polβ蛋白的表达水平，初步验证polβ是否是miR-149的靶基因。 7.构建野生型polβ3’UTR区重组报告质粒（pmirGLO-Wt-polβ）和突变型polβ3’UTR区重组报告质粒（pmirGLO-Mu-polβ），将实验细胞分为四组：miR-149mimics和pmirGLO-Wt-polβ共转组，miR-149mimics和pmirGLO-Mu-polβ共转组，miR-149NC和pmirGLO-Wt-polβ共转组，miR-149NC和pmirGLO-Mu-polβ共转组。双荧光素酶报告实验检测萤光素酶的活性，验证miR-149的靶基因。 8.用SPSS21.0软件对得出的实验数据进行统计学分析，以α=0.05作为显著性检验标准。 结果： 1.荧光定量PCR实验结果显示，食管癌组织中polβmRNA的表达水平明显高于其配对癌旁组织（P＜0.05），癌组织中miR-149的表达水平明显低于其配对癌旁组织（P＜0.05）。 2.Pearson相关性分析结果显示：食管癌肿瘤组织和其配对癌旁组织polβmRNA和miR-149表达水平呈负相关（r=-0.671，P＜0.001）。 3.生物信息学分析发现，miR-149和polβ的3’UTR区存在互补结合位点。 4.Western blot实验结果显示EC9706细胞中，miR-149组中polβ蛋白表达水平明显低于Blank组和NC组。 5.双荧光素酶报告实验结果：在EC9706细胞中，共转染miR-149mimics和pmirGLO-Wt组细胞的荧光素酶活性明显低于其它三组（P＜0.05）。证实polβ是miR-149的靶基因。结合Western blot实验结果提示，miR-149通过结合polβmRNA的3'UTR区负调节polβ的表达。 结论： 食管癌组织中miR-149呈现异常低表达，且与polβ的表达水平呈负相关。食管癌EC9706细胞中polβ是miR-149的靶基因。miR-149通过作用于polβ的3’UTR区，负向调控其表达。

目录

声明

中英文缩略词表

1 引言

2 实验材料

2.1 标本的收集

2.2 细胞株

2.3 载体

2.4 引物

2.4.1 miR-149实时荧光定量PCR检测引物

2.4.2 U6检测引物

2.4.3 polβmRNA实时荧光定量PCR检测引物

2.4.4β-actin检测引物

2.4.5野生型polβ 3'UTR片段扩增引物

2.4.6 突变型polβ3'UTR片段扩增引物

2.5 主要试剂与耗材

2.6 主要仪器

2.7 常用试剂配制

2.7.1miR-149 mimics和miR-149NC的溶解

2.7.2 细胞完全培养基的配制

2.7.3 细胞冻存液配制

2.7.4Western blot实验相关试剂配制

2.7.5 细菌培养液体培养基的配制

2.7.6 细菌培养固体培养基的配制

2.7.7 50×TAE电泳缓冲液的配制

2.7.8 琼脂糖凝胶的制备

3 实验方法

3.1 食管癌及癌旁组织中miR-149表达水平的检测

3.1.1 提取组织中总RNA

3.1.2 逆转录

3.1.3 实时荧光定量PCR检测

3.2 食管癌及癌旁组织标本中polβmRNA表达的检测

3.2.1 逆转录

3.2.2 实时荧光定量PCR检测

3.3 靶基因预测

3.4 细胞培养及转染

3.4.1 细胞培养

3.4.2 细胞转染

3.4.3 转染效果检测

3.5 Western blot实验

3.5.1 总蛋白提取

3.5.2 测定蛋白浓度

3.5.3Western blot凝胶电泳

3.6Polβ 3'UTR双荧光素酶报告载体的构建

3.6.1 pmirGLO双粘载体的制备

3.6.2 野生型(Wt)polβ3'UTR 双荧光素酶报告质粒的构建

3.6.3 突变型 (Mu)polβ3'UTR双荧光素酶报告质粒的构建

3.7 双荧光素酶报告实验

3.7.1 细胞处理

3.7.2 上机检测

3.8 统计学分析

4 实验结果

4.1食管癌组织中miR-149的表达情况

4.2 食管癌组织中polβ的表达情况

4.3食管癌组织中miR-149和polβ mRNA表达之间的关系

4.4miR-149和polβ mRNA作用关系的探索

4.4.1生物信息学分析结果

4.4.2 上调miR-149的表达对polβ蛋白表达的影响

4.5 双荧光素酶报告实验靶基因验证结果

4.5.1野生型和突变型pmirGLO-polβ 3'UTR报告质粒构建结果

4.5.2 双荧光素酶报告实验结果

参考文献

综述:miRNAs在食管癌中的研究进展

个人简历

致谢