伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的表达及其表达蛋白间接ELISA诊断方法的研究

摘要

(伪狂犬病Pseudorabies，PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病毒的天然宿主和贮存者，该病给养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制并最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在欧美等发达国家的伪狂犬病根除计划中，多采用gE缺失标记疫苗和相应的gE抗体鉴别诊断方法。同时gE糖蛋白也是PrV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但gE不是PrV增殖所必需的蛋白，因此可作为缺失的候选基因。目前我国已研制成功gE基因标记疫苗。为了建立适合我国国情的gE鉴别诊断方法，开展了以下研究。 1.PrVgE基因的主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达 将伪狂犬病病毒(PrV)MinA株gE基因主要抗原表位区0.63kb的片段融合到原核表达载体pET-28a的T7启动子下游，构建成原核表达质粒，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western-blot印迹分析，证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达，表达产物具有抗原性，分子量为29kD，位于包涵体中。 2.表达蛋白的纯化与复性 MinA株gE基因主要抗原区在pET-28a表达载体中表达产量较高，但是都以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，尿素和TritonX-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAGE分析电泳结果表明，尿素和TritonX-100可洗去部分杂蛋白，8mol/L尿素能很好的溶解包涵体，回收率约20％，其纯度可达85％左右。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与PrV阳性血清反应的特异性有明显提高。 3.gE-ELISA的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的gE蛋白作为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测伪狂犬病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为14.5ug/ml，最佳包被时间为37℃1h，再4℃过夜；伪狂犬阳性血清(1∶80)在37℃作用1h；二抗(1∶3000)37℃作用1h。通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。以该方法检测100份己知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94％，诊断敏感性为96％。以3块不同批次包被抗原的酶标板检测10份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10％，表明该方法重复性好。对比国外阻断gE-ELISA同时检测80份猪血清，两者符合率为96.3％(77/80)。本研究结果为伪狂犬诊断方法的标准化提供了实验基础，为伪狂犬病的诊断与监测提供一种良好的技术手段。

目录

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致谢

摘要

第一章文献综述

第二章研究目的和意义

第三章猪伪狂犬病病毒闽A株gE基因的克隆表达及其抗原多肽的变性复性研究

第四章以重组gE630抗原建立检测伪狂犬抗体间接ELISA方法的研究

参考文献