枣WRKY转录因子鉴定、响应植原体侵染过程中的表达特性及其功能预测

摘要

枣（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）植物，是我国的重要果树树种。枣树的栽培过程中常常伴随着病虫害的发生，其中最为严重的是由植原体侵染而引起的枣疯病，堪称枣树的癌症。为研究WRKY转录因子基因在枣疯病发病过程中可能发挥的作用以及枣与植原体的相互作用机制，利用生物信息学的方法，鉴定出枣WRKY转录因子家族的成员，并对枣疯病发病过程中部分枣WRKY转录因子的转录水平进行分析和荧光定量PCR试验验证，同时分析了水杨酸和茉莉酸甲酯处理后几个枣WRKY转录因子基因的表达量变化。主要结果如下:
　　1、通过嫁接转染植原体，提取植原体侵染后不同时期的枣叶片RNA，进行转录组测序。根据转录组数据并结合NCBI数据库信息，鉴定出69个枣WRKY转录因子，并对其进行系统进化树构建，染色体定位，保守结构域比对及基序分析。结果显示69个枣WRKY转录因子都含有WRKY保守结构域，可分为GroupⅠ，GroupⅡ以及GroupⅢ3个亚组，分别含有17、41、11个成员，且不均匀的分布在枣树的12条染色体上，在7号染色体上没有匹配到相应的ZjWRKY转录因子。
　　2、从枣疯病发生过程中枣叶片的转录组数据中检测到28个ZjWRKY转录因子的差异表达主要集中在嫁接后38-52w。对表达量上调的6个基因ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69进行荧光定量PCR验证，试验结果显示在枣疯病发病过程中ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61、ZjWRKY69基因表达量发生明显变化（上调）。说明这几个基因可能在枣树防御植原体的过程中发挥作用。
　　3、为进一步分析研究枣WRKY转录因子在植原体防御过程中的潜在作用，用水杨酸和荣莉酸甲酯处理枣胚培苗，荧光定量PCR检测ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因在处理不同时间的表达量变化，试验结果显示SA处理后，ZjWRKY42和ZjWRKY52的表达量显著升高;MeJA的积累诱导了ZjWRKY42和ZjWRKY61的表达量发生较明显变化。
　　4、构建了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因的过表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，分别获得了15个转ZjWRKY8基因的抗性芽，28个转ZjWRKY52基因的抗性芽，16个转ZjWRKY61基因的抗性芽。
　　5、ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因在烟草叶片中瞬时过量表达后，用0.1mol·L-1的H2O2处理叶片，结果显示ZjWRKY8、ZjWRKY61基因过表达的烟草叶片中CAT的活性水平都高于对照，而SOD活性只在0-12h高于对照叶片;DAB组织化学染色结果显示ZjWRKY8过表达的烟草叶片中黄色沉淀明显增加。

目录

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致谢

缩略词表Abbreviation

摘要

第一章 文献综述

1 枣疯病研究现状

1．1 枣疯病病原及感病症状

1．2 枣疯病抗病机制的研究

2．1 植物转录因子概念

2．2 WRKY家族转录因子

2．3 WRKY转录因子功能研究

第二章 枣WRKY转录因子的基因组分析

2．2 试验方法

2．3 枣转录组测序

2．4 枣WRKY家族转录因子的基因组分析

2．5 实时荧光定量PCR分析

2．6 水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫处理

3．1 枣WRKY转录因子家族成员鉴定与命名

3．2 枣WRKY转录因子与拟南芥WRKY家族的进化树分析及其分类

3．3 枣WRKY转录因子的染色体定位

3．4 枣WRKY转录因子的保守结构域及基序分析

3．5 枣WRKY转录因子在植原体胁迫下的差异表达分析

3．6 差异表达基因的实时荧光定量PCR分析

3．7 水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫分析

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

第三章 枣ZjWRKY8、52、61的烟草遗传转化和瞬时表达

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 基因克隆

3．2 表达载体及转化农杆菌鉴定

3．3 烟草遗传转化

3．4 PCR检测

3．5 CAT，SOD酶活测定

3．6 DAB染色

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

参考文献