PP2C磷酸酶调节氧化还原信号转导机制

摘要

ROS在生物体内广泛存在，其动态的平衡能参与植物生物与非生物胁迫，也能和各种激素相互作用来参与植物的许多生命进程，例如植物的生长和发育、生物和环境的刺激、植物的新陈代谢和细胞程序性死亡。GPX是清除ROS最主要的酶之一，可以通过氧化还原态的变化清除自由基。拟南芥中的AtGPX3也具有感知和清除H2O2的双重功能。ABA调节气孔关闭的信号通路中的负调控因子AtABI2/1的活性受H2O2的抑制。但是AtABI1和AtGPX3在活性氧中的作用机理还不清楚。
　　首先，为了研究AtABI1在活性氧中的作用，构建了有PP2C活性的AtABI1(119-434 AA)和 AtGPX3的原核表达载体，并研究两者在活性氧中的作用。通过 Non-reducing SDS-PAGE分析发现当AtABI1和AtGPX3不同状态混合时，可以发生状态的改变。我们推测这种转换是由于二者之间的电子转移引起。我们根据同源序列比对和结晶结构分析，找到可能引起氧化还原变化的关键氨基酸 Cys，并将其突变为 Ser或 Ala。点突变的蛋白进行氧化还原分析，发现影响AtABI1氧化还原状态的位点同时也影响了氧化环境中同AtGPX3的互作，AtGPX3调控氧化还原状态的位点也参与活性的调节。为了研究H2O2对AtABI1的影响，发现H2O2浓度不仅影响了AtABI1的活性，同时也影响了蛋白的状态。即AtABI1的活性不受氧化还原状态的影响，而是随着聚合状态的增强而降低。氧化还原状态却可以增强 AtABI1和 AtGPX3之间的作用力，氧化还原缺失的C359S和AtGPX3的作用力最强。
　　上述实验说明AtABI1和AtGPX3之间发生电子转移后会立即分开，若不能进行正常的电子转移，就会形成稳定的复合体，并抑制 AtABI1的活性。最让人意外的结果是C208S虽然和野生型一样具有氧化还原和聚合状态，但是其活性几乎不受H2O2的影响。那么Cys208有可能是AtABI1感受高浓度H2O2关键性氨基酸。即AtABI1利用自身的氧化还原和聚合状态并配合AtGPX3等相关蛋白调节自身的活性，来感受不同程度的氧化胁迫。为了验证上述生化结果，构建了AtABI1及突变体C208S、C359S或C188S相关的超表达材料与回补材料，并对所得的材料进行了简单的生理分析。

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目录

1 前 言

1.1 ROS代谢

1.2 ROS信号转导

1.3 ROS生物学意义

1.4 PP2Cs与ROS信号

1.6 立题依据

2 材料和方法

2.1 常用仪器

2.2 常用实验软件及生物网站

2.3 实验材料、载体及菌株

2.4 实验试剂与耗材

2.5 实验溶液配制

2.6 实验方法

3 结果与分析

3.1 AtABI1序列与结构分析

3.2 AtABI1氧化还原状态及其与AtGPX3偶联变化

3.3 AtABI1潜在和AtGPX3氧化还原状态偶联变化的突变体创制

3.4 氧化还原态不影响AtABI1活性

3.5 H2O2浓度影响AtABI1活性

3.6 AtABI1和AtGPX3互作

3.7 AtABI1状态对H2O2浓度依赖性

3.8 超表达材料的创制

3.9 回补材料的创制

4 讨 论

5 结 论

参考文献

致谢