肝细胞生长因子对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化调节作用的研究

摘要

目的：肾间质纤维化是导致肾功能衰竭的主要决定因素。肾间质纤维化的发生发展是一个复杂的过程，涉及多种细胞因子及细胞内信号转导通路。肾小管间质病变及其严重程度往往决定着肾脏疾病的预后。因此，探讨肾小管间质纤维化的发病机制及防治措施具有重要的临床意义。转化生长因子β1(Transforming growth factor。TGF-β1)在多种纤维化疾病中均发挥强效的致纤维化作用。TGF-β1通过促进足细胞、内皮细胞、小管上皮细胞及间质成纤维细胞产生大量的基质成份，.以及肾小管上皮细胞转分化，导致肾小球硬化及小管间质纤维化，最终发展成为终末期肾衰竭。活化素受体样激酶(Activin Receptor-like Kinase)家族，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，特别是ALK5对于活化的TGF-β1发挥其生物学活性至关重要。提示ALK5与慢性肾间质纤维化的发生发展密切相关。ALK5受体能够活化其下游的Smad及P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase P38 MA PK)信号通路，将TGF-β1信号传导至细胞内，促进细胞外基质(extracelluarmatrix,ECM)沉积。肝细胞生长素(Hepatocyte growth factor HGF)作为一种多效性因子，对于肾损伤后肾小管的修复与再生至关重要。HGF通过抑制TGF-β1的表达；抑制成纤维细胞活化及细胞外基质的过度生成；加速细胞外基质降解；阻断肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化；抑制细胞凋亡；促进细胞增殖等方面，发挥肾脏保护作用。注射用促肝细胞生长素(Hepatocyte Growth-promoting Factors for Injection)是从动物肝脏中提取的小分子多肽类活性物质，目前主要应用于重症肝炎和早期肝硬化的临床治疗。迄今为止，国内外尚未见促肝细胞生长素对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)大鼠模型肾组织HGF、TGF-β1、ALK5表达影响的研究。本实验以UUO大鼠模型为研究对象，观察肾脏组织病理改变，并应用免疫组织化学方法检测HGF、TGF-β1、ALK5的表达情况，同时应用促肝细胞生长素进行干预，探讨肾间质纤维化中HGF、TGF-β1，、ALK5的表达变化及促肝细胞生长素对其影响，为临床防治肾间质纤维化提供试验性理论依据。 方法：选择清洁级健康雄性Wistar大鼠54只，体重(200±10)克，随机分为三组：假手术组(正常对照组，A组)，单侧输尿管结扎组(UUO组，B组)，促肝细胞生长素干预组(C组)，每组各18只。每组又因于术后第3、7、14天分批处死而分为N3、N7、N14组，每组各6只。将B、C组大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左侧耻骨上切口，沿左肾下极寻找到左侧输尿管，在中上1/3处用4号线上下结扎两处，然后从中剪断输尿管，以防逆行性感染。A组除不结扎和剪断输尿管外，其他手术过程同前。C组大鼠以促肝细胞生长素0.5mg/(Kg·d)腹腔注射，1次/日；A和B组大鼠用等容积生理盐水腹腔注射，1次/日，三组均于术前一天开始注射至术后第3天、第7天和第14天，实验期间自由进食水。术后第3天、7天、14天各组随机选取6只大鼠分三批颈椎离断处死，后立即取出大鼠左肾组织，分别用苏木素伊红(HE)、Masson染色，光镜下观察各组大鼠肾组织病理变化，应用图像分析系统进行半定量分析。采用免疫组织化学方法测定肾间质HGF、TGF-β1、ALK5的表达，结果应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差(-x±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，应用SPSS11.5统计分析软件对实验数据进行统计学处理，P＜0.05为有统计学意义。 结果：光镜下观察，HE及Masson染色A组未见异常。HE染色可见B组及C组各时相点大鼠肾脏肾小球均无明显变化。B组术后3天肾小管扩张不明显，可见肾间质炎症细胞局灶浸润，肾间质宽度增加；第7天肾小管扩张明显，上皮细胞变性、水肿、甚至坏死，肾间质大量炎症细胞浸润，间质宽度明显增加，偶见萎缩肾小管；第14天上述病变加重，可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩，小管基底膜不同程度断裂，皮质及外髓萎缩的肾小管较多，间质中大量淋巴单核细胞浸润，纤维化较明显。Masson染色可见B组术后3天肾小管扩张，肾间质宽度增加，胶原纤维增加，染色加深；此后，病变逐渐加重。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻，肾间质相对面积明显减少(P＜0.05)。三组间比较均有统计学差异(P＜0.05)。免疫组织化学结果显示：TGF-β1在A组在肾小管间质、肾小球微量表达。在B组各时相点TGF-β1的表达随时间呈进行性升高，且随梗阻时间延长表达逐渐上调。B组组间及与A组同时相点相比均有统计学差异(P＜0.05)。C组术后第3天、第7天、第14天TGF-β1的表达均显著低于同时期B组的表达(P＜0.05)，但仍高于同期A组(P＜0.05)。ALK5在A组各时期均几乎无表达。在B组主要表达于肾小管上皮细胞，肾间质有少量表达，随着梗阻时间的延长，肾间质纤维化程度的加重，ALK5的表达逐渐增多，有统计学意义(P＜0.05)。C组与B组同时相点相比ALK5的表达均减少，组间、组内均有统计学差异(P＜0.05)。HGF在A组各时期均几乎无表达。在B组主要表达于肾小管上皮细胞，于第3天表达最高，第7天稍有回落，第14天表达最弱，但均高于同期A组(P＜0.05)。与同期B组相比，C组术后第3天、第7天、第14天HGF的表达均显著高于同时期B组的表达(P＜0.05)。 结论：在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质中TGF-β1、ALK5的表达明显升高，且随着梗阻时间的延长，其表达数量也逐渐增加，出现肾间质纤维化；而HGF的表达在早期迅速增加，后期随着梗阻时间的延长，其表达数量也逐渐降低，出现肾间质纤维化。促肝细胞生长素能有效抑制肾间质中TGF-β1、ALK5的过度表达，促进肾间质中HGF表达，从而能够改善UUO大鼠肾脏组织形态学变化，减轻肾小管扩张及肾间质单核-淋巴细胞浸润，并减少肾小管间质胶原的沉积，延缓肾间质纤维化。

目录

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摘要

前言

材料与方法

结果

附图（一）

附图（二）

附表

讨论

结论

参考文献

综述肝细胞生长因子与肾间质纤维化

致谢

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