胚肝细胞诱导肝癌细胞株HepG2再分化中调控环路的重建

摘要

目的：
　　全球癌症数据显示，肝癌发病率是世界所有恶性肿瘤的第5位，每年约有70万人死于肝癌。我国是全球肝癌发病率最高的国家，肝癌发病人数超过全球发病人数的50％，其中90%以上为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。然而，目前对于HCC的治疗存在着切除率低、肝源有限、毒副作用大、复发率高等问题，即使在发达国家，5年的相对生存率不到15%，严重威胁着人类生命健康。因此，阐明HCC的发病机制，寻求有效根除HCC的方法，成为生命科学界和医学界的重点和难点。
　　早在20世纪70年代，Pierce等人提出了肿瘤是一个发育生物学问题的理论。更多的研究证实，早期胚胎发育和肿瘤发生在许多方面存在着惊人的相似性，如早期胚胎细胞的分化和增殖机制与肿瘤细胞的分化和增殖机制；早期胚胎植入与肿瘤的侵袭性转移；两者的免疫逃避机制等。Misirlioglu等证实肿瘤细胞有胚胎性基因的表达，如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和胰胚抗原(pancreatic oncotetal antigen,POA)等；继而，Dvorak等研究发现胚胎植入子宫内膜的过程也有大量肿瘤形成过程中癌基因的表达。Hochedlinger等也同样证实了胚胎微环境可能存在调控肿瘤细胞向特定细胞分化并改变其恶性表型的机制。据此，导师齐锦生教授提出，胚胎细胞诱导肿瘤细胞的再分化具有组织和时间特异性，用特定发育阶段的胚肝细胞与肝癌细胞HepG2共培养，可诱导肝癌细胞HepG2的再分化，且已经实验证实，本实验旨在此基础上进一步探讨诱导分化过程中的主要分子机制。
　　Young等人发现肝细胞中，HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间通过相互调节及自我调节作用形成了高度关联的核心转录调控环路。相关研究也发现，肝富集转录因子(Liver enriched transcription factors,LETFs)包括C/EBP、DBP、HNF3、HNF1、HNF4、HNF6在胚肝的发育和分化过程中起着至关重要的作用。HNF4α是调节肝细胞分化和功能特异性的关键因子，其表达维持着肝正常的分化状态和功能，表达缺失则会刺激肝细胞增殖导致HCC。因此，HNF4α可看作HCC的抑癌基因，可能成为治疗HCC的一个新靶点。
　　本实验小组前期试验证明，13.5天和14.5天的胚肝细胞与肝癌细胞HepG2细胞共培养48h后，HepG2细胞生长明显抑制，且部分细胞回缩、变圆，最终崩解；HepG2细胞中分化标志HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1在转录水平和蛋白水平均上调，原癌基因 c-Myc在转录水平和蛋白水平均下调；HepG2细胞中AFP蛋白含量明显下降。说明胚肝细胞可诱导肝癌细胞的再分化，且具有组织和时间特异性。然而，肝癌细胞 HepG2再分化过程是否是重建了 HepG2细胞中 HNF4α、HNF1α、HNF6和 USF1的核心调控环路；HNF4α是否是此调控环路的核心因子；仍需进一步的实验证明。
　　本实验旨在在前期实验结果的基础上，进一步揭示胚肝细胞诱导肝癌细胞再分化的主要分子机制。首先用13.5d的胚肝细胞与肝癌细胞HepG2共培养48h后，利用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术，检测HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1的核心调控环路的重新建立。在转染siRNA-HNF4α(si-HNF4α)，敲低HepG2细胞中 HNF4α的表达，检测共培养后，HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1转录水平和蛋白水平的变化，进一步证明HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的相互调控作用；利用免疫荧光法检测HepG2细胞中AFP的表达变化；探明了阻断HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的调控环路后，对胚肝细胞诱导肝癌细胞的再分化过程的影响。据此，探讨胚肝细胞诱导肝癌细胞再分化的主要分子机制，为治疗HCC提供实验依据。
　　方法：
　　1.细胞的培养
　　HepG2细胞: HepG2细胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培养基培养，0.25%的胰蛋白酶消化传代，接种于100ml培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
　　原代胚肝细胞分离及培养：采用Ⅳ胶原酶消化法，从孕鼠腹中取得胎鼠，分离出胚肝，将胚肝组织剪成组织块，Ⅳ胶原酶消化胚肝组织块，成功分离为单个胚肝细胞；多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞，纯化胚肝细胞；高糖DMEM培养胚肝细胞。
　　2.实验设计与分组：
　　(1)诱导HepG2细胞再分化的过程中，检测HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的相互调节作用，实验分成2组：untreated组(单纯HepG2细胞)；co-culture组(HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h)。
　　(2)用Lipofectamine2000(Lipo2000)将FAM-siRNA转入HepG2细胞中，转染效率的评价，实验分成2组：转染试剂对照(Mock)组；FAM-siRNA组。
　　(3)HepG2细胞中转染si-GAPDH，计算阳性对照的抑制率，实验分成2组：Mock组；si-GAPDH组。
　　(4)HepG2细胞转染si-HNF4α，不同靶点si-HNF4α的抑制率，按照同一siRNA(pmol)与Lipo2000(μl)比例(1:0.05)，不同靶点分成5组：Mock组；阴性对照(si-NC)组；si-HNF4α-273(si-T1)组；si-HNF4α-297(si-T2)组；si-HNF4α-699(si-T3)组。
　　(5)HepG2细胞中转染 si-HNF4α，不同浓度 si-HNF4α的抑制率，按照同一靶点(HNF4α-273)，不同siRNA(pmol)与Lipo2000(μl)比例，分成5组：Mock组；si-NC组；1:0.04组；1:0.05组；1:0.06组。
　　(6)HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，实验分成4组：untreated组(单纯 HepG2细胞)；co-culture组；co-culture+si-NC组；co-culture+si-HNF4α组。
　　3.胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2再分化的过程中，HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1相互调节作用的检测
　　收集细胞，ChIP技术检测HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之间的相互调节作用。
　　4.HepG2细胞转染siRNA，转染效率、si-GAPDH抑制率和si-HNF4α抑制率的计算
　　利用荧光显微镜和流式细胞术计算转染效率。
　　Trizol一步法提取HepG2细胞中总RNA，用β-actin做内参，Real-time PCR方法检测GAPDH和HNF4α的mRNA表达，计算GAPDH和HNF4α的抑制率。
　　5.肝癌细胞HepG2转染si-HNF4α后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc转录水平的检测
　　Trizol一步法分别提取 HepG2细胞中总 RNA；用β-actin做内参， Real-time PCR方法检测HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc的mRNA表达。
　　6.肝癌细胞HepG2转染si-HNF4α后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1蛋白水平的检测
　　RIPA裂解法分别提取HepG2细胞中总蛋白，Lowry法测定蛋白含量，Western-blotting检测HepG2细胞中HNF4α、HNF1α和USF1的蛋白含量。
　　7.肝癌细胞HepG2转染si-HNF4α后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中AFP蛋白含量的检测
　　利用免疫荧光法检测，HepG2细胞中AFP的表达量。
　　结果：
　　1.原代胚肝细胞的分离纯化及培养
　　采用Ⅳ型胶原酶消化法，首先将胚肝组织剪成组织块，Ⅳ胶原酶消化胚肝组织块，成功分离为单个胚肝细胞；多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞，纯化胚肝细胞；高糖DMEM培养胚肝细胞，利用免疫荧光法检测胚肝细胞中表达胚肝细胞特异蛋白AFP，提示原代胚肝细胞培养成功。2 ChIP技术检测与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1相互调节作用的变化
　　2.1.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF4α在HNF1α的启动子区的结合作用(6.366±0.099, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.2.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF4α在USF1的启动子区的近端的结合作用(28.485±1.080, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.3.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF4α在USF1的启动子区的远端的结合作用(19.924±0.622, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.4.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内USF1在HNF6的启动子区的结合作用(5.606±0.475, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.5.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF6在HNF4α的启动子区近端的结合作用(2.445±0.181, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.6.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF6在HNF4α的启动子区远端的结合作用(2.767±0.187, P<0.05)与untreated组相比显著升高；
　　2.7.HepG2细胞与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，HepG2细胞内HNF1α在HNF4α的启动子区的结合作用(2.623±0.079, P<0.05)与untreated组相比显著升高。
　　3.HepG2细胞中转染si-HNF4α，敲低HepG2细胞中HNF4α的表达后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，检测HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc转录水平的变化
　　3.1.HepG2细胞中转染FAM-siRNA，用荧光显微镜及流式细胞术计算转染效率>90%；
　　3.2.HepG2细胞中转染si-GAPDH，HepG2细胞中GAPDH的相对表达量(0.437±0.022, P<0.01)，与Mock组相比明显下降；
　　3.3.HepG2细胞中转染不同靶点的si-HNF4α，HepG2细胞中HNF4αmRNA的相对表达量与Mock组相比，si-NC组(1.057±0.030,P>0.05)无明显变化，si-T1组(0.366±0.022,P<0.01)，si-T2组(0.552±0.037,P<0.01)，si-T3组(0.692±0.027,P<0.01)，均明显下降；
　　3.4.HepG2细胞中转染不同浓度的si-HNF4α，HepG2细胞中HNF4αmRNA的相对表达量与Mock组相比，si-NC组(1.063±0.040,P>0.05)无明显变化，1:0.04组(0.318±0.033,P<0.01)，1:0.05组(0.391±0.035,P<0.01)，1:0.06组(0.514±0.021,P<0.01)，均明显下降；
　　3.5 HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h， HepG2细胞中HNF4α mRNA的相对表达量co-culture组与 untreated组(0.481±0.015, P<0.01)相比，co-culture组明显升高；HepG2细胞中HNF4αmRNA的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(1.029±0.093,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.319±0.008,P<0.05)明显下降；
　　3.6.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中 HNF1αmRNA的相对表达量co-culture组与 untreated组(0.252±0.049,P<0.01)相比，co-culture组明显升高；HepG2细胞中HNF1αmRNA的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(0.980±0.063,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.203±0.039,P<0.05)明显下降；
　　3.7.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中HNF6 mRNA的相对表达量co-culture组与 untreated组(0.365±0.010,P<0.01)相比，co-culture组明显升高；HepG2细胞中HNF6 mRNA的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(0.933±0.062,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.286±0.019,P<0.05)明显下降；
　　3.8.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中USF1 mRNA的相对表达量co-culture组与 untreated组(0.529±0.038, P<0.01)相比，co-culture组明显升高；HepG2细胞中 USF1 mRNA的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(0.974±0.058,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.429±0.003,P<0.05)明显下降；
　　3.9.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中c-Myc mRNA的相对表达量co-culture组与 untreated组(2.133±0.173,P<0.05)相比，co-culture组明显降低；HepG2细胞中c-Myc mRNA的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(1.104±0.074,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(1.622±0.178,P<0.05)明显升高。
　　4.HepG2细胞中转染si-HNF4α，敲低HepG2细胞中HNF4α的表达后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，检测共培养后，HepG2细胞中HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc蛋白水平的变化
　　4.1.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中 HNF4α蛋白的相对表达量与 untreated组(0.440±0.017, P<0.01)相比，co-culture组(1.920±0.052)明显升高；HepG2细胞中HNF4α蛋白的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(1.857±0.016,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.971±0.015, P<0.01)明显下降；
　　4.2.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h， HepG2细胞中HNF1α蛋白的相对表达量与 untreated组(1.168±0.050,P<0.01)相比，co-culture组(1.750±0.056)明显升高；HepG2细胞中HNF1α蛋白的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(2.005±0.069,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.558±0.017,P<0.01)明显下降；
　　4.3.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中HNF6蛋白的相对表达量与untreated组(0.615±0.032,P<0.01)相比，co-culture组(1.004±0.068)明显升高；HepG2细胞中 HNF6蛋白的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(1.008±0.065,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.677±0.049,P<0.05)明显下降；
　　4.4.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中USF1蛋白的相对表达量与untreated组(0.688±0.023,P<0.01)相比，co-culture组(1.293±0.033)明显升高；HepG2细胞中USF1蛋白的相对表达量与 co-culture组相比，co-culture+si-NC组(1.219±0.043,P>0.05)无明显变化，co-culture+si-HNF4α组(0.659±0.018,P<0.01)明显下降；
　　4.5.HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，HepG2细胞中c-Myc蛋白的相对表达量与 untreated组(0.344±0.013,P<0.01)相比，co-culture组(0.210±0.014)明显下降；HepG2细胞中c-Myc蛋白的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组(0.531±0.037,P<0.01)和co-culture+si-HNF4α组(0.317±0.016,P<0.05)都明显升高。
　　5.HepG2细胞中转染si-HNF4α，敲低HepG2细胞中HNF4α的表达后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h，免疫荧光检测HepG2细胞中AFP蛋白水平的变化
　　HepG2细胞转染si-HNF4α24h后，再与13.5d的胚肝细胞共培养48h后，免疫荧光法检测HepG2细胞中AFP蛋白的相对表达量与untreated组相比，co-culture组明显降低；HepG2细胞中 AFP蛋白的相对表达量与co-culture组相比，co-culture+si-NC组无明显变化，co-culture+si-HNF4α组明显升高。
　　结论：
　　本实验揭示：小鼠胚肝细胞诱导人肝癌细胞 HepG2再分化的分子机制是，重建了肝癌细胞HepG2中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1等因子间的调控环路；阻断此环路则诱导再分化作用下降。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果

附图

附表

讨论

1从胚胎发育角度认识肿瘤的起源

2干细胞与肿瘤关系的研究

3胚胎微环境对肿瘤的影响

4导师提出诱导肿瘤细胞再分化的特异性

5调控肝癌细胞再分化的重要转录因子

6利用RNA干扰技术证实肝癌细胞HepG2再分化的分子机制

7本实验研究的意义

8有待深入研究的内容

结论

参考文献

综述:胚肝分化的分子机制研究

致谢

个人简历