丁苯酞对1型糖尿病大鼠认知功能及海马MEK1表达的影响

摘要

目的:糖尿病认知功能障碍以学习记忆能力损害为主，最终导致痴呆，其发病机制尚未阐明，亦缺乏行之有效的防治手段。突触是神经系统结构和功能的基础、神经元之间信息传递的重要通道，突触可塑性与学习记忆密切相关。MAPK/ERK通路在海马突触可塑性中起关键作用，该信号通路是高度保守的三级激酶级联信号，即Ras/MEK/ERK，其中MEK1是ERK激活所需的高选择性激酶，是该通路激活的重要中间环节。本研究重点观察糖尿病大鼠发生认知障碍时海马MEK1的变化以及丁苯酞对糖尿病大鼠认知障碍的影响，有可能发现丁苯酞新的治疗靶点，对糖尿病认知障碍的防治具有重要的理论与实际意义。
　　 方法:通过一次性腹腔注射大剂量链脲佐菌素(STZ，60mg.kg-1，i.p.)建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并设立正常对照组。72h鼠尾静脉取血测定血糖，≥16.7mmol/L为造模成功。随后将糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组，丁苯酞低剂量干预组(60mg.kg-1.d-1，i.g.)，丁苯酞高剂量干预组(120mg.kg-1.d-1，i.g.)。每周测大鼠体重及血糖，血糖＜16.7mmol/L则剔除。第12W行Morris水迷宫学习记忆行为学测试，之后称体重、测血糖，麻醉后处死大鼠，留取海马组织。HE染色观察海马组织形态，免疫组织化学染色、逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR)与蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测大鼠海马组织中MEK1mRNA和p-MEK1蛋白的表达水平。
　　 结果:
　　 1、一般情况
　　 正常对照组大鼠体重平稳增长，精神状况良好，毛色正常。而糖尿病大鼠则出现消瘦，精神萎靡，毛色枯黄无光泽，尿量、饮水量、进食量、明显增多。
　　 2、血糖及体重变化
　　 注射STZ前，正常对照组与糖尿病模型组大鼠血糖均正常，差异无统计学意义(7.19±0.92mmol/L比7.34±0.77mmol/LP＞0.05);两组大鼠体重差异无统计学意义(148.06±7.53g比149.28士4.29g，P＞0.05)。注射STZ成模后6W末和12W末，相比正常对照组大鼠，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组血糖均显著增高(P＜0.01），但体重明显低于同期正常对照组大鼠，差异有统计学意义(P＜0.01）;而糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠之间血糖相比及体重相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3、Morris水迷宫测试结果
　　 3.1、大鼠基础游泳速度测试结果
　　 水迷宫测试前，在正常对照组、糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组中每组随机抽取5只大鼠自由游泳60S，测定基础游泳速度。结果显示，4组大鼠之间游泳速度的差别不具有统计学意(28.23±1.64cm/s，29.79±2.34cm/s，30.10±3.19cm/s分别比30.77±2.60cm/s，P＞0.05)，所以本实验不考虑大鼠个体游泳速度的因素。
　　 3.2、定位航行测试结果
　　 与正常对照组相比，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠逃避潜伏期均明显延长，差异具有统计学意义(P＜0.05），证明糖尿病大鼠出现了认知障碍;与糖尿病对照组相比，丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05);丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠的逃避潜伏期在第1天和第2天无显著差异，从第3天到第5天丁苯酞高剂量组大鼠的逃避潜伏期相比丁苯酞低剂量组明显缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05）;连续5天的测试结果显示，4个测试组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短，均为第1天＞第2天＞第3天＞第4天＞第5天，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 3.3、空间探索测试结果
　　 与正常对照组相比，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠穿越平台的次数明显减少(3.17±0.61，9.17±1.72，12.67±1.78分别比16.33±2.71，P＜0.05);与糖尿病对照组相比，丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠穿越平台的次数显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）;与丁苯酞低剂量组相比，丁苯酞高剂量组大鼠穿越平台次数明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 4、HE染色结果
　　 正常对照组大鼠海马CA1区细胞排列整齐，神经元核大而圆;糖尿病对照组大鼠海马CA1区细胞排列紊乱，数目减少，细胞核着色加深，有些神经元细胞出现质、核界限不清，甚至空泡变性;丁苯酞干预组上述改变较糖尿病组明显减轻，且120mg.kg-1丁苯酞干预组优于60mg.kg-1丁苯酞干预组。
　　 5、免疫组化染色结果
　　 与正常对照组相比，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达明显减少（平均光密度值为0.14±0.00，0.25±0.02，0.34±0.02分别比0.41±0.02，P＜0.05）;与糖尿病对照组相比，丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）;与丁苯酞低剂量组相比，丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 6、基因表达结果
　　 RT-PCR显示:与正常对照组相比，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中MEK1mRNA表达量均明显减少(0.16±0.00，0.25±0.00，0.33±0.01分别比0.40±0.01，P＜0.05);与糖尿病对照组相比，丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中MEK1mRNA表达量均显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）;与丁苯酞低剂量组相比，丁苯酞高剂量组海马组织中MEK1mRNA表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 7、蛋白表达结果
　　 Western-blot显示:与正常对照组相比，糖尿病对照组、丁苯酞低剂量组和丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达量明显减少(0.21±0.00，0.41±0.00，0.52±0.01分别比0.64±0.01，P＜0.05);与糖尿病对照组相比，丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）;与丁苯酞低剂量组相比，丁苯酞高剂量组大鼠海马组织中p-MEK1蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、成模第12周糖尿病大鼠学习记忆能力明显下降，同时海马组织中p-MEK1的表达减少。提示p-MEK1表达减少可能是糖尿病大鼠发生认知障碍的潜在机制。
　　 2、丁苯酞使糖尿病大鼠海马组织p-MEK1的表达增加、学习记忆能力提高，对认知障碍有一定的预防作用，可能与其上调海马p-MEK1的表达，激活了MAPK/ERK信号通路有关。
　　 3、另外本研究结果显示，高剂量丁苯酞(120mg.kg-1)对糖尿病认知障碍的预防作用优于低剂量(60mg.kg-1)。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 一般情况

2 血糖及体重变化

3 Morris水迷宫测试结果

4 HE染色结果

5 免疫组化染色结果

6 基因表达结果

7 蛋白表达结果

附图

附表

讨论

1 糖尿病大鼠模型的建立

2 Morris水迷宫

3 糖尿病大鼠发生认知障碍时海马神经元形态和MEK1的变化

4 丁苯酞对糖尿病大鼠认知障碍和海马神经元形态与MEK1的影响

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历