肝素结合性表皮生长因子对肝星状细胞胶原代谢及迁移的影响

摘要

肝纤维化是对由于病毒、代谢、酒精、化学毒物、遗传等各种原因导致的慢性肝脏损伤的应答及修复反应，这一进程会致使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过多沉积，多以Ⅰ型胶原为主。若是病因持续存在，肝纤维化最后将会发展成肝硬化甚至于肝癌。肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)的活化、增殖，致使ECM大量合成及异常堆积，是形成肝纤维化的中心环节。
　　HSC是肝脏的非实质细胞，健康状态下以静止形式存在于正常肝脏中。多数研究显示，当致病因素作用于肝脏使肝受到损害时，HSC即转变为激活形态且持续增殖，大量Ⅰ型胶原等的分泌推进了肝纤维化的发生、发展进程，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是调节ECM降解的重要细胞因子，而活化的HSC是其主要来源。多种细胞因子能够引起HSC增殖、胶原合成及细胞迁移，如表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等。
　　肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-likegrowth factor, HB-EGF)是表皮生长因子受体家族(ErbB)的配体之一，且拥有一个与肝素相结合的特殊区域。它可以结合表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1和ErbB4)，激活细胞内信号转导通路;经由丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路，参加了许多细胞的增殖与迁移过程。研究表明，HB-EGF能够促进HSC的增殖、抑制凋亡，其对HSC胶原代谢及细胞迁移的影响尚不明确。
　　本课题研究HB-EGF对肝星状细胞胶原代谢和细胞迁移的影响，进一步探讨HB-EGF在肝纤维化发生过程中的作用，从而作为了解肝纤维化的发生机制和给予有效医治的理论依据。
　　目的:研究HB-EGF对HSC胶原代谢及细胞迁移的影响，探讨HB-EGF影响细胞生物学行为的机制。
　　方法:人肝星状细胞株HSC LX-2用于实验，运用体外HSC培养技术，应用HB-EGF的特异性抑制剂CRM197预干预24h，外源性给予HB-EGF干预24h。免疫细胞化学方法检测α-SMA的表达;Western Blot方法检测Ⅰ型胶原、α-SMA的表达;Real time-PCR方法检测α-SMA、Ⅰ型胶原、MMP-1和TMP-1的mRNA表达;ELISA法检测Ⅰ型胶原、MMP-1和TIMP-1蛋白表达;采用划痕实验方法检测细胞迁移能力。
　　结果:①免疫细胞化学方法检测α-SMA的表达:HB-EGF组较control组阳性表达的细胞明显增多，CRM197组较control组阳性表达减少。②Western blot方法检测α-SMA的蛋白表达，HB-EGF组(0.74±0.04)较control组(0.43±0.02)升高，CRM197组(0.33±0.01)与control组(0.43±0.02)相比、HB-EGF+CRM197组(0.44±0.02)与HB-EGF组(0.74±0.04)相比，表达下降(P＜0.01）;检测Ⅰ型胶原的蛋白表达，HB-EGF组(0.57±0.06)与control组(0.36±0.02)比较，表达升高(P＜0.05); CRM197组(0.14±0.02)与control组(0.36±0.02)相比、HB-EGF+CRM17组(0.17±0.02)与HB-EGF组(0.57±0.06)相比，表达下降(P＜0.01）。③Real time-PCR方法检测α-SMA的mRNA表达，control组、HB-EGF组、HB-EGF+CRM17组、CRM197组结果分别为1、4.37±0.43、1.97±0.26、0.32±0.12，结果与Western blot结果一致(P＜0.01）;检测Ⅰ型胶原的mRNA表达，HB-EGF组(4.77±0.62)较control组(1±0)明显升高(P＜0.01），CRM197组(0.15±0.05)与control组(1±0)相比、HB-EGF+CRM17组(0.49±0.18)与HB-EGF组(4.77±0.62)相比，表达下降(P＜0.05）;检测TIMP1、MMP1表达:HB-EGF组与control组相比，TIMP1表达增加(5.90±0.34 vs1±0)(P＜0.01)，MMP1的表达无明显差异(1.27±0.20 vs1±0)(P＞0.05），MMP1/TIMP1比值下降(0.22±0.04、1±0)（P＜0.05）。④ELISA方法检测Ⅰ型胶原、TIMP1、MMP1的表达，结果与Real time-PCR结果一致(P＜0.05）。⑤划痕实验检测细胞迁移:干预后检测划痕未融合面积，HB-EGF组(1.23±0.1)比control组(1.78±0.3)明显减小，CRM197组(2.49±0.38)比control组(1.78±0.3)增大，两组之间有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论:HB-EGF使HSC的α-SMA表达增多，证实HSC进一步活化;HB-EGF促进HSC胶原合成;HB-EGF可通过从mRNA水平增加TIMP-1的表达，从而加剧MMP-1和TIMP-1比例失衡，抑制已合成的ECM降解、促进沉积;HB-EGF促进细胞迁移。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂的配制

3 方法

4 统计学处理

结果

1 HB-EGF促进HSC-LX2活化

2 HB-EGF对MMP1 mRNA表达及蛋白表达的影响

3 HB-EGF对TIMP1 mRNA表达及蛋白表达的影响

4 HB-EGF在mRNA和蛋白水平对MMP1／TIMP1的影响

5 HB-EGF促进HSC Ⅰ型胶原蛋白和mRNA的表达

6 HB-EGF促进HSC细胞迁移

附图

讨论

结论

参考文献

综述 肝纤维化与肝素结合性表皮生长因子

致谢

个人简历