亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢抑制子代大鼠患高血压的机制研究

摘要

大量的流行病学资料表明，胚胎期以及胎儿期的环境因素与出生之后患心血管疾病有直接关系。早在1953年，Barker提出“胎儿编码成人疾病”这一假说。随后大量的研究证实了上述观点。并且使表观遗传学在环境相关疾病中的作用得到了重视。由于表观遗传学的介入，有可能为高血压的防治提供新的策略。寻找新型的表观药物干预高血压的发生发展，将成为研究热点。
　　硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）是继一氧化氮、一氧化碳之后的第三种气体信号分子。在体内合成H2S的酶主要有胱硫醚β-合酶（cystathionineβ-synthase, CBS），胱硫醚γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase, CSE）以及3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。血浆H2S水平在高血压患者体内明显降低。最早H2S作为舒血管物质被大家认识，随后越来越多的研究发现，H2S具有多种生物效应，可以调节神经递质释放，降低交感紧张性等。最近研究还发现，H2S可以舒张人胎盘血管，改善胎盘血供，降低先兆子痫的发生。H2S有可能作为新的表观药物应用于临床。
　　肾血管性高血压（renovascular hypertension, RVH）是最常见的继发性高血压。它是以夹闭一侧肾动脉造成肾缺血，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）其中血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）是RAAS的主要成员。Ang II与血管紧张素II受体1（angiotensin II type1 receptor, AT1R）结合主要引起血压升高。AT1R分为AT1a和AT1b，在体内广泛存在。已有研究证实RAAS的激活参与了多种高血压的发病机制。因此，肾血管性高血压大鼠被认为是研究高血压发病机制的合适模型。原发性高血压一般被认为有遗传倾向，但是继发性高血压是否也有遗传倾向呢，还少有报道。
　　本课题旨在，以RVH大鼠为模型，采用清醒状态下记录动物的心血管参数，观察 RVH大鼠子代患高血压的情况，更接近生理状态。应用western blot以及DNA甲基化检测技术，分别从蛋白和基因水平探讨其患病机制。通过围产期以及断奶后给予 H2S观察其作用及机制。本课题分为以下三部分：（1）亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢对清醒状态下子代大鼠的血压以及压力感受性反射的影响；（2）亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢对清醒状态下子代大鼠自主神经系统的影响；（3）亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢是否可以影响子代大鼠AT1b基因的甲基化表达
　　第一部分：亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善清醒状态下子代大鼠的血压以及压力感受性反射的敏感性
　　目的：观察 H2S对肾血管性高血压大鼠子代大鼠的血压，以及压力感受性反射的敏感性的影响，并探讨其相关机制。
　　方法：
　　1制备肾血管性高血压大鼠模型
　　7周的SD雌雄大鼠应用“两肾一夹”方法制备肾血管性高血压大鼠模型。
　　2实验分为四组：
　　正常SD大鼠子代组（Control），肾血管性高血压大鼠子代组（F1NF2N），肾血管性高血压大鼠亲代 H2S治疗组（F1HF2N），肾血管性高血压大鼠子代H2S治疗组（F1NF2H），其中F1HF2N组亲代雌鼠围产期（怀孕开始至哺乳期结束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H2S供体）；F1NF2H组孕鼠围产期不做处理，生产后子鼠5周开始，每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g）。
　　3测量清醒状态动脉血压
　　所有子代大鼠从产后8周开始，采用鼠尾动脉测压系统（DSWY-1，成都仪器厂）测量清醒状态下大鼠的尾动脉收缩压（systolic blood pressure, SBP），每2周测一次血压，至16周。
　　4记录肾交感神经放电
　　腹膜后位暴露肾动静脉，在动脉旁区域分离肾神经，记录肾交感神经放电活动。
　　5应用我们实验室传统的方法，灌流一侧颈动脉窦。
　　6检测清醒动物压力感受性反射敏感性
　　制备清醒动物动静脉插管，分别记录血压和给药，将插管引导到颈背部皮肤。应用Ang II100μg/ml、苯肾上腺素（phenylephrine, PHE）1mg/ml、硝普纳（sodium nitroprusside, SNP）2mg/ml，诱导清醒状态下压力感受性反射。
　　7检测孤束核（nucleus tractus solitarius, NTS）蛋白表达
　　通过western blot技术检测NTS血管紧张素II受体1（angiotensin II type1 receptor, AT1R）、CBS、以及氧化应激、炎症相关蛋白NOX4、NLRP3、IL-1β的表达。
　　结果：
　　1各组子代大鼠清醒血压的变化
　　1.1雄性子代大鼠清醒血压的变化
　　从8周到16周龄 F1NF2N组雄性子代大鼠的收缩压明显高于 Control组，达到临界高血压的水平，并且具有统计学差异，分别为8周131.9±5.78 vs.113.48±4.08 mmHg；10周133.42±8.08 vs.117.42±5.44 mmHg；12周132.38±4.06 vs.116.76±4.41 mmHg；14周133.63±5.29 vs.112.45±6.45 mmHg；16周135.22±7.08 vs.116.72±4.45 mmHg（P<0.05）。给予NaHS处理后均可以改善上述现象。
　　1.2雌性子代大鼠清醒血压的变化
　　从8周龄和16周龄 F1NF2N组雌性子代大鼠的收缩压均高于 Control组，但并未达到临界高血压水平。具体数值分别为8周123.6±3.05 vs.100.02±11.88 mmHg；10周122.67±1.98 vs.103.28±9.50 mmHg；12周124.58±2.9 vs.105.70±5.45 mmHg；14周119.53±4.77 vs.107.07±6.46 mmHg；16周118.69±4.89 vs.106.95±7.42 mmHg（P<0.05）。给予NaHS处理后均可以改善上述现象。
　　2 H2S对麻醉状态雄性 SD大鼠肾交感神经介导的压力感受性反射的影响
　　颈动脉窦急性给予NaHS灌流可以通过增加压力感受性反射敏感性，使肾神经放电减少，这一作用与颈动脉窦区 CSE蛋白表达无关，而与颈动脉窦区离子通道有关，开放钾通道，促进钾离子外流，关闭钙通道，阻止钙离子内流实现。
　　3各组子代大鼠压力感受性反射的变化
　　3.1雄性子代大鼠压力感受性反射的变化
　　静脉给予Ang II，与Control组相比，F1NF2N组雄性子代大鼠在8周龄和16周龄压力感受性反射的敏感性均下降；静脉给予PHE，在8周龄和16周龄的压力感受性反射的敏感性均下降，静脉给予SNP，在8周龄和16周龄的压力感受性反射的敏感性无统计学差异。
　　3.2雌性子代大鼠压力感受性反射的变化
　　静脉给予Ang II，与Control组相比，F1NF2N组雌性子代大鼠在8周龄和16周龄的压力感受性反射的敏感性均下降；静脉给予 PHE，在16周龄的压力感受性反射的敏感性下降，静脉给予SNP，在8周龄和16周龄的压力感受性反射的敏感性无统计学差异。
　　4各组子代大鼠NTS蛋白水平的变化
　　4.1雄性子代大鼠NTS蛋白水平的变化
　　与Control组相比，F1NF2N组雄性子代大鼠在8周龄和16周龄NTS AT1R、NLRP3蛋白表达均增高；16周龄，F1NF2N组NOX4、IL-1β蛋白表达高于Control组；16周龄F1NF2N组CBS蛋白表达低于Control组。
　　4.2雌性子代大鼠NTS蛋白水平的变化
　　F1NF2N组雌性子代大鼠8周龄和16周龄的AT1R、NLRP3蛋白表达高于Control组；NOX4蛋白表达，各组之间无统计学差异；16周龄的F1NF2N组IL-1β蛋白表达高于Control组；16周龄F1NF2N组CBS蛋白表达高于Control组。
　　小结：
　　本部分实验发现肾血管性高血压大鼠雄性子代血压升高至临界高血压水平，雌性子代大鼠尚处于正常血压范围，具有性别差异；雌雄子代大鼠压力感受性反射的敏感性均下降，可能与NTS AT1R蛋白表达上调以及氧化应激和炎症的激活有关，由于雌激素的保护作用通过下调 NTS的NOX4，增加CBS对抗Ang II引起的损伤作用，这可能就是雌雄子代血压差异的原因。首先我们发现 H2S可以改善正常麻醉大鼠压力感受性反射，进而降低肾交感神经的兴奋性。明确了 H2S对压力感受性反射的易化作用。在此基础上，随后通过围产期和断奶后给予NaHS处理，通过下调NTS AT1R的表达以及抑制下游的氧化应激和炎症的激活，易化子代大鼠压力感受性反射，降低血压。
　　第二部分：亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善清醒状态下子代大鼠自主神经系统的稳态
　　目的：观察 H2S对肾血管性高血压大鼠子代大鼠自主神经系统的影响，并探讨其相关机制。
　　方法：
　　1制备肾血管性高血压大鼠模型
　　2实验分为四组：
　　正常SD大鼠子代组（Control），肾血管性高血压大鼠子代组（F1NF2N），肾血管性高血压大鼠亲代 H2S治疗组（F1HF2N），肾血管性高血压大鼠子代H2S治疗组（F1NF2H），其中F1HF2N组亲代雌鼠围产期（怀孕开始至哺乳期结束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H2S供体）；F1NF2H组孕鼠围产期不做处理，生产后子鼠从5周开始，每天腹腔注射NaHS(56μmol/Kg，0.2ml/100g)。
　　3检测子代大鼠自主神经系统功能
　　为了确定子代大鼠自主神经系统的功能，选取上述各组8周龄和16周龄的子代大鼠，动静脉置管分别记录动脉血压和给药，应用文献描述的方法，分别给予硫酸阿托品（2.5mg/Kg）和普萘洛尔（4mg/Kg）观察自主神经系统的变化。
　　4检测延髓腹外侧头端（rostral ventrolateral medulla, RVLM）蛋白表达
　　通过western blot技术检测RVLM AT1R、以及NOX4、NLRP3、IL-1β、CBS蛋白的表达。
　　结果：
　　1各组子代大鼠自主神经系统的变化
　　1.1雄性子代大鼠自主神经系统的变化
　　8周龄的雄性子代大鼠，与 Control组相比，F1NF2N组交感紧张性增加（49.83±10.52 vs.89.4±10.02bpm P<0.05）；16周龄的雄性子代大鼠，交感紧张性增加（63.25±8.61 vs.83.21±5bpm P<0.05），交感的效应也是增加的（41.25±4.78 vs.64.5±5.66bpm P<0.05），给予NaHS处理组均可以改善上述现象。
　　1.2雌性子代大鼠自主神经系统的变化
　　各组16周龄的雌性子代大鼠，与Control组相比，F1NF2N组交感的效应增加（35.5±3 vs.82.00±5.6bpm P<0.05）。而NaHS处理组，可以改善上述现象。
　　2各组子代大鼠RVLM蛋白水平的变化
　　2.1雄性子代大鼠RVLM蛋白水平的变化
　　与Control组相比，8和16周龄F1NF2N组雄性子代大鼠RVLM AT1R、NOX4蛋白表达增高；16周龄，F1NF2N组 NLRP3、IL-1β蛋白表达高于Control组；16周龄F1NF2N组CBS蛋白表达低于Control组。
　　2.2雌性子代大鼠RVLM蛋白水平的变化
　　8周龄和16周龄的F1NF2N组雌性子代大鼠AT1R、NOX4蛋白表达高于Control组；16周龄的F1NF2N组NLRP3、IL-1β蛋白表达高于Control；16周龄F1NF2N组CBS蛋白表达高于Control组。
　　小结：
　　本部分实验发现肾血管性高血压大鼠子代交感神经兴奋性增高，迷走神经兴奋性降低，自主神经系统稳态失衡。这可能与RVLM AT1R、NOX4、NLRP3、IL-1β蛋白水平表达上调有关。同时内源性H2S参与了高血压子代大鼠的自主神经系统失衡，雌性子代大鼠通过上调内源性 H2S的生成对抗Ang II引起的交感激活，阻止自主神经系统稳态失衡。
　　第三部分：亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善子代大鼠AT1b基因的甲基化表达
　　目的：观察肾血管性高血压大鼠子代大鼠AT1b基因启动子区甲基化情况，并探讨其相关机制。从基因水平进一步明确H2S的作用机制。
　　方法：
　　1制备肾血管性高血压大鼠模型
　　2实验分为四组：
　　正常SD大鼠子代组（Control），肾血管性高血压大鼠子代组（F1NF2N），肾血管性高血压大鼠亲代 H2S治疗组（F1HF2N），肾血管性高血压大鼠子代H2S治疗组（F1NF2H），其中F1HF2N组亲代雌鼠围产期（怀孕开始至哺乳期结束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H2S供体）；F1NF2H组孕鼠围产期不做处理，生产后子鼠5周开始，每天腹腔注射NaHS56μmol/Kg，0.2ml/100g。
　　3检测肾脏蛋白表达
　　western blot法测定16周龄各组子代大鼠肾脏AT1R蛋白的表达。
　　4检测肾脏AT1b基因启动子区甲基化情况
　　提取组织DNA，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKits试剂盒说明，进行硫酸化修饰，设计特异性的PCR引物，以硫酸化修饰好的DNA为模板，应用Master Mix Reagent Kit，配反应体系，放入PCR仪进行扩增。构建pBLUE-T载体克隆，菌液送到测序公司进行序列测定。
　　结果：
　　1子代大鼠肾脏 AT1R蛋白水平的变化
　　16周龄的雌雄子代大鼠，雌雄子代 F1NF2N组 AT1R蛋白表达均高于Control组，有统计学差异。
　　2观察AT1b基因启动子区NW_047624.110592171–10592486位置的甲基化情况
　　我们观察 AT1b基因启动子区转录起始位点上游（ NW_047624.110592171–10592486）15个CG位点，发现全部甲基化，各组之间没有任何差异。
　　3观察AT1b基因启动子区Genbank U01033277–1611位置的甲基化情况
　　我们观察 AT1b基因启动子区转录起始位点上游 Genbank U01033277–1611位置7个CG位点的甲基化情况。一代测序结果发现起始上游的三个CG位点甲基化发生了改变。与对照相比，肾血管性高血压子代大鼠甲基化程度降低（66.67％±0 vs.27.78%±25, P<0.05），围产期以及出生之后给予NaHS均可以增加其甲基化程度。
　　4构建 pBLUE--T载体克隆，观察 AT1b基因启动子区 Genbank U01033277–1611上游的三个CG位点的甲基化情况
　　为了进一步验证上述实验结果，各组每只动物 PCR产物构建pBLUE--T载体，挑选10个克隆子，集中分析上述三个CG位点的甲基化情况，与对照相比，发现肾血管性高血压子代大鼠甲基化程度降低（15.33%±6.91 vs.3.89%±3.89, P<0.05），围产期以及出生之后给予NaHS均可以增加其甲基化程度。
　　小结：
　　本部分主要研究发现肾血管性高血压大鼠子代大鼠肾脏AT1b基因甲基化水平降低，AT1R蛋白水平升高，围产期以及断奶后给予NaHS均可以增加AT1b基因甲基化水平，降低AT1R蛋白水平。本部分实验从基因水平进一步明确了肾血管性高血压大鼠子代血压升高的具体机制以及H2S的作用机制。
　　结论：
　　本实验主要研究发现肾血管性高血压大鼠雄性子代血压升高至临界高血压水平，雌性子代大鼠血压虽升高，但尚处于正常血压范围。具体机制如下：1.肾血管性高血压子代大鼠 AT1b基因甲基化水平降低，使体内AT1R蛋白水平升高，进而激活其下游的氧化应激以及炎症反应，造成压力感受性反射钝化，交感系统激活，自主神经功能紊乱，导致血压升高。2.由于雌激素的保护作用，通过上调 CBS蛋白的表达，增加内源性 H2S的产生；减轻氧化应激，对抗 AngII/AT1R引起的损伤，使得血压虽有升高，但尚处于正常水平。3.围产期给予亲代大鼠NaHS处理或者断奶后子代大鼠给予NaHS，使AT1b基因甲基化水平增加，体内AT1R蛋白水平降低，降低氧化应激以及炎症反应，增加了压力感受性反射的敏感性，降低了交感系统激活，使血压降低。

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引言

第一部分亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善清醒状态下子代大鼠的血压以及压力感受性反射的敏感性

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善清醒状态下子代大鼠自主神经系统的稳态

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分亲代肾血管性高血压大鼠围产期给予硫化氢可以改善子代大鼠AT1b基因的甲基化表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:表观遗传学在心血管疾病中的研究进展

致谢

个人简历