阿霉素对人肝癌细胞株HepG2中ABCB1表达的影响

摘要

目的:肝癌在国内属于常见恶性肿瘤之一，目前肝癌的诸多治疗方法中首选的治疗方法是手术切除，但因为疾病本身特点所致肝切除术后效果欠佳，复发率亦较高。同时，由于肝癌发病较为隐蔽，不易被发现，大多数肝癌患者被发现时已经到了中期甚至晚期，错过了适合手术切除的最佳时间。因此，在治疗肝癌而进行的肝切除术后，化疗也是必不可少的治疗手段。化疗在预防肝癌复发、转移，以及延长病人的生存时间、改善和提高生命质量方面具有重要的意义。但是，化疗效果往往很难达到理想状态，这与肝癌细胞的强耐药性相关。在对肿瘤患者死亡原因的研究结果进行分析时，大量临床资料统计数据显示，其中90％以上的病例死亡与其化疗时出现耐药性密切相关。因此，深入研究肝癌细胞耐药发生的分子机制以及涉及到的通路，可以明确肝癌细胞耐药机制，并为寻找肝细胞癌新的、有效的治疗靶点提供理论依据。
　　目前针对肝细胞癌的化疗药物多种多样，如阿霉素，紫杉醇，5-Fu和顺铂等。这些都是肝癌化疗的一线药物，与此同时，也造成了多药耐药(MDR)的发生。多药耐药基因ABCB1位于人类7号染色体长臂2区1带，属于ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白家族成员，其过度表达成为了肿瘤细胞对化疗药物发生耐药的主要原因，但肝癌细胞对阿霉素耐药性的出现是否与ABCB1过表达有关，至今未见报道。因此，详细研究ABCB1在肝癌细胞对阿霉素耐药过程中的作用具有重要的临床意义。
　　阿霉素(Doxorubicin)是一种抗肿瘤抗生素，对RNA和DNA的合成有显著的抑制作用。其药理作用中，抑制作用最强的方面体现在对RNA的抑制作用方面。其优点是抗瘤谱较广泛，并且多种肿瘤的抑制作用都比较显著。阿霉素属于周期非特异性药物，对各种生长阶段的肿瘤细胞都有杀灭作用。阿霉素是当前公认的肝癌切除术后重要的辅助治疗手段，且其临床疗效已经得到多方面的确认。
　　为此，本研究探讨阿霉素对人肝癌细胞株HepG2及其耐药细胞株中ABCB1表达的影响，从而进一步阐明ABCB1表达水平改变与肝癌细胞产生化疗耐药性的关系，为探索新的肝癌治疗方法、克服肿瘤耐药性提供理论依据。
　　方法:本试验采用常规细胞培养方法来培养普通肝癌细胞HepG2，建立其对阿霉素的耐药细胞株(HepG2/Doxorubicin)，并观察耐药细胞株与亲本细胞形态学差异;采用MTT实验方法，观察阿霉素对人肝癌细胞HepG2、以及其耐药细胞株增殖周期的抑制作用;实验方法方面则采用RT-PCR和Western Blot相结合的实验方法，从mRNA水平和蛋白表达水平进行研究，以期观察人肝癌细胞HepG2、以及耐药细胞株HepG2/Doxorubicin中ABCB1变化情况。将实验测得的不同浓度阿霉素对耐药细胞株HepG2/Doxorubicin抑制率变化与ABCB1 mRNA变化进行相关分析，为推断ABCB1与HepG2细胞耐药性的关系提供依据。
　　结果:1.亲本细胞呈梭形，排列比较密集，大小也比较均匀，贴壁生长，细胞间边界清晰;耐药细胞株则表现为生长缓慢，形状变得不规则，体积略有增大，核皱缩，胞浆内出现空泡，堆叠生长。
　　2.RT-PCR和Western Blot法检测ABCB1在HepG2亲本细胞和耐药株中mRNA和蛋白表达水平，结果显示耐药株均明显高于其亲本细胞。
　　3.MTT法检测亲本细胞及其耐药细胞株的耐药性，耐药细胞株在实验中不同浓度的阿霉素作用下，与亲本细胞株相比，其生长抑制率(Inhibition ratio)可观察到明显降低，呈现出一定程度上的耐药性。
　　4.不同浓度阿霉素对耐药细胞株HepG2/Doxorubicin抑制率与ABCB1mRNA水平呈负相关关系，即随着ABCB1mRNA水平升高，阿霉素对HepG2/Doxorubicin的抑制作用下降，耐药性增强。
　　结论:阿霉素可抑制人肝癌细胞株HepG2的生长增殖。人肝癌细胞株HepG2对阿霉素产生耐药后，细胞株中ABCB1表达水平明显增高。随着ABCB1 mRNA水平升高，耐药性增强。为今后临床化学药物治疗肝癌患者时考虑采用联合疗法提供一定的理论依据，为完善肝癌多药耐药机制注入了新的内容。

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