温氏附红细胞体抗原特性及16S rRNA基因系统进化分析研究

摘要

牛附红细胞体病是由温氏附红细胞体(E.wenyoni)引起的一种传染病。长期以来，由于该病多呈隐性感染，发病率较低，未引起人们的足够重视。近年来研究发现，该病的发病率呈上升趋势，成为影响养牛业发展的主要疾病之一。同时，国内外对温氏附红细胞体的研究相对较少，有关形态学特性、分类地位、诊断准确性、有效预防等问题都亟待进一步研究。本试验采用自然感染E.wenyoni的牛血为试验材料，对E.wenyoni的抗原特性及其16SrRNA基因特点进行了研究：首先，研究了E.wenyoni的形态学特点、运动性及其对牛血液学指标及免疫指标的影响，旨在探索E.wenyoni的致病机理，并为确诊牛附红细胞体病提供理论与实践依据；其次，从自然感染牛血液中纯化附红细胞体，应用SDS-PAGE和免疫印迹试验对E.wenyoni抗原蛋白组分进行了初步分析，为制备特异性诊断抗原、提高血清学诊断的特异性和准确性以及研制高效附红细胞体疫苗奠定基础；最后，对E.wenyoni16SrRNA基因进行了扩增，对扩增产物进行克隆和测序，构建系统发育树并进行分析，目的在于从系统进化角度探讨E.wenyoni的分类学地位。 显微镜观察发现，被感染的红细胞变形，E.wenyoni呈多形性，具有折光性，游离于血浆中的E.wenyoni具有运动性，附着于红细胞上后，似乎停止运动，但实际上能使红细胞发生震颤；血液学指标测定结果表明：随着感染强度的增加，牛血液中红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和红细胞比容(HCT)均降低，而白细胞数(WBC)、红细胞渗透脆性和红细胞沉降率(ESR)却增加；免疫指标测定结果显示：高强度感染牛的红细胞C3b受体花环(C3bRR)率、红细胞免疫复合物花环(ICR)率以及血液中ANAE+T淋巴细胞百分率均降低，这表明牛严重感染后，红细胞免疫及细胞免疫处于低下状态。 SDS-PAGE结果显示，E.wenyoni全蛋白分子量范围为24kD～150kD，主要的9种蛋白质分子量分别为141.34kD，107.27kD，86.03kD，68.05kD，56.21kD，44.30kD，32.99kD，28.89kD，24.59kD。应用免疫印迹试验筛选出了3种特异性蛋白质，分子量分别为147.31kD，49.03kD，35.72kD。 克隆了E.wenyoni16SrRNA部分基因，测序结果显示：所测序列与GenBank发表的E.wenyoni16SrRNA基因序列(AF016546)相似性最高，达97.9﹪。系统发育分析表明，所测序列与支原体属病原代表种的序列接近，同源性约为70﹪，而与无浆体科病原代表种的序列相差较远，同源性约为50﹪。可见，E.wenyoni应归为支原体属，而不属于立克次氏体目、无浆体科。

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1引言

2材料与仪器

3方法与程序

4结果与分析

5讨论

6结论

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