小鼠胚胎体外培养方法的改良

摘要

尽管早期胚胎体外操作有一定的研究进展，然而体外培养的胚胎质量仍然较低，其着床与妊娠率仍然低于体内正常发育的胚胎，我们建立一种动态的微环境胚胎培养系统将模拟胚胎体内发育的纤毛摆动与输卵管收缩的机械刺激与微小的生化环境以改进胚胎培养系统以进一步提高胚胎质量与发育潜能。
　　采用内径0.21 mm、外径0.28 mm的塑料毛细管培养胚胎，将吸有胚胎的毛细管浸在盛有蒸馏水的烧杯内，再将烧杯放置在培养箱里的磁力搅拌器上，允许胚胎在微小的空间内发育并伴随着水的旋转而摆动，更好地模拟了胚胎在输卵管中的运动环境。通过大量实验数据验证表明毛细管规格为34 G，磁力搅拌器的转速为180r/min时，效果最佳。
　　1)分别对85枚、82枚2-细胞胚胎进行毛细管及微滴培养，其中毛细管培养胚胎的囊胚率以及胚胎细胞数(85.4％，57.0)显著高于微滴培养(36.5％，20.6)，囊胚率差异显著(P＜0.05）。且接种在Matrigel基底膜上形成的内细胞团集落显著增大;2）毛细管培养的胚胎，将1-细胞胚胎、2-细胞胚胎用毛细管培养法培养至囊胚阶段(E3.5d)用非手术法移植到3.5d的假孕鼠体内，正常体内发育的胚胎(E3.5 d)取出后，用非手术法移植到3.5 d的假孕鼠体内。10.5 d后剖腹产，结果表明毛细管培养的胚胎与体内正常发育的胚胎同期发育，差异不显著(P＞0.05);3）嵌合体的制备，采用无GFP标记的恒河猴胚胎内细胞团样干细胞，注射到毛细管培养与微滴培养获得的8-细胞/囊胚中，胚胎移植到2.5 d的假孕鼠体内，E13-E14 d后进行小鼠全胚免疫荧光检测，发现毛细管培养的嵌合率(37/83)要明显高于微滴培养的胚胎(28/79)，嵌合比例差异显著(P＜0.05）;此外采用有GFP标记的恒河猴胚胎内细胞团样干细胞，注射到二细胞内，并对其进行毛细管培养，培养至八细胞期/囊胚期(E3.5 d)，在荧光显微镜下观察，结果表明，毛细管培养支持胚胎嵌合。
　　小鼠胚胎体外培养方法的改良——毛细管培养，促进小鼠植入前胚胎的体外发育。优于传统的微滴培养方法。且毛细管培养法符合实验动物伦理原则。重要的是该方法为生物医药研究及人类而辅助生殖等领域的胚胎体外培养提供了研究模型。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略表

1 引言

1．1 胚胎体外培养研究背景

1．1．1 哺乳动物的早期胚胎体外培养研究背景

1．1．2 小鼠早期胚胎体外培养研究背景

1．2 早期胚胎体外培养体系的建立

1．2．1 早期胚胎体外培养体系：培养基

1．2．2 早期胚胎体外培养体系：共培养

1．2．3 早期胚胎体外培养体系：胚胎密度

1．2．4 早期胚胎体外培养体系：培养系统

1．3 早期胚胎体内发育环境

1．3．1 早期胚胎在输卵管内的动态变化

1．3．2 输卵管内环境的周期性变化

1．4 胚胎体外发育的量化标准与质量评估

1．5 嵌合体的制备

1．5．1 诱导多能干细胞概述

1．5．2 恒河猴胚胎内细胞团样干细胞的建立

1．5．3 诱导多能干细胞的验证方法

1．6 本研究的意义及其主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验试剂及药品

2．1．2 实验仪器与耗材

2．1．3 主要试剂配置

2．2 实验动物

2．2．1 实验小鼠的饲养与管理

2．2．2 小鼠发情判定

2．2．3 结扎雄鼠的制备

2．2．4 受体母鼠的准备

2．2．5 小鼠超数排卵

2．2．6 拾卵针的制备

2．2．7 胚胎收集

2．3 胚胎培养方法的建立

2．3．1 设计原理

2．3．2 材料

2．3．3 制作方法

2．3．4 毛细管培养

2．3．5 微滴培养

2．4 胚胎发育判定方法

2．4．1 胚胎发育观察判定标准

2．4．2 囊胚细胞染色计数

2．4．3 胚胎贴壁能力检测

2．4．4 胚胎移植--非手术法

2．5 恒河猴内胚层样可诱导多能干细胞与小鼠体外培养胚胎的嵌合实验

2．5．1 细胞准备

2．5．2 显微注射

2．5．3 胚胎移植及剖腹产

2．5．4 小鼠胚胎免疫组化

2．5．5 小鼠全胚免疫荧光鉴定

2．6 实验设计

2．6．1 不同毛细管粗细规格比较

2．6．2 不同转速比较

2．6．3 不同培养方法对小鼠2-细胞胚胎发育率的影响

2．6．4 不同培养方法对小鼠2-细胞胚胎单胚胎发育率的影响

2．6．5 不同培养方法对小鼠受精卵发育率的影响

2．6．6 毛细管培养法与体内胚胎发育情况的比较

2．6．7 嵌合体的制备

2．6．8 嵌合体胚胎的培养

2．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 不同毛细管粗细规格比较

3．2 不同转速比较

3．3 2-细胞胚胎微滴培养与毛细管培养

3．4 2-细胞微滴单个胚胎培养与毛细管单个胚胎培养

3．5 1-细胞胚胎培养

3．6 毛细管培养法与体内发育情况的比较

3．7 嵌合体胚胎的制备

3．8 毛细管培养嵌合体胚胎

4 讨论

4．1 毛细管培养法优于微滴培养

4．2 毛细管培养法的优势

4．3 毛细管培养法模拟了输卵管内环境

4．4 毛细管培养法支持单个胚胎培养

4．5 毛细管培养法与体内发育同步

4．6 异种胚胎嵌合体的制备、培养、与鉴定

5 结论

参考文献

在读期间发表的论文

作者简历

致谢