利用多重PCR和荧光定量PCR对羊肉进行定性定量鉴定方法的建立

摘要

为了对羊肉进行定性鉴别，本试验建立了一个多重PCR方法，可以一次性对山羊、绵羊、水貂、海狸鼠和鸭肉进行鉴别。利用线粒体基因设计五对引物，使山羊、绵羊、水貂、海狸鼠和鸭的扩增目的片段长度分别为577bp、265bp、231bp、812bp和351bp。通过特异性检测，发现各物种引物仅能扩增出相应物种，其余物种均无扩增结果;且引物和引物之间、模板和模板之间均无干扰现象。通过引物浓度优化试验，可确定各物种引物的比例为山羊∶绵羊∶水貂∶海狸鼠∶鸭=3∶5∶4∶2∶3。通过退火温度优化试验，确定了多重PCR的最佳退火温度为59℃。
　　为了对羊肉进行定量鉴别，本试验利用荧光定量Taqman探针法PCR，在线粒体Cyt b基因上对山羊和绵羊设计特异性引物和探针，并同时在16S rRNA基因上设计内参引物和探针，对山羊和绵羊在混合肉样中的含量进行测定。本试验用DNA含量建立标准曲线，并对各物种质量与所提DNA含量的关系（D值）进行测量。通过对已知混合肉样的测量，可知山羊肉含量的平均相对误差为6.82％，绵羊肉含量的平均相对误差为8.14％。
　　分别对多重PCR方法和荧光定量PCR方法进行灵敏性检测。试验证明，多重PCR反应的DNA模板最低检测限是0.1ng，而荧光定量PCR方法的最低检测限为0.01ng。两种方法均能用于检测经高温煮沸和高压处理的肉样。对多重PCR方法的待检肉样掺入不同比例的玉米粉，检测结果无明显影响。
　　对含羊肉的混合肉样进行定性定量鉴定的方法步骤为:(1)提取模板DNA;(2)用多重PCR方法确定物种组成;(3)测量混合肉样组成物种的D值;(4)建立山羊或绵羊DNA标准曲线;(5)对混合肉样的DNA进行荧光定量PCR;(6)计算山羊肉或绵羊肉在混合肉样中的含量。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 宏观形态学鉴定

1．2 利用蛋白质进行鉴别的方法

1．2．1 酶联免疫法

1．2．2 电泳法

1．2．3 色谱法

1．3 利用核酸进行鉴别的方法

1．3．1 DNA探针杂交

1．3．2 基于PCR技术的检测方法

1．4 本研究目的意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 仪器与试剂

2．2．1 试验仪器

2．2．2 试验试剂及配制方法

2．3 试验方法

2．3．1 材料处理

2．3．2 引物设计合成

2．3．3 反应条件优化

2．3．4 引物特异性分析

2．3．5 多重PCR体系的建立

2．3．6 荧光定量PCR检测方法的建立

2．3．7 灵敏性检测

2．3．8 山羊、绵羊定性定量检测方法的验证

3 结果与分析

3．1 基因组DNA的提取

3．2 引物序列特异性对比结果

3．3 反应条件优化结果

3．3．1 引物最佳浓度优化结果

3．3．2 引物最佳退火温度探索结果

3．4 引物特异性分析结果

3．4．1 引物的物种特异性试验结果

3．4．2 多重PCR引物间干扰分析试验结果

3．4．3 多重PCR模板间干扰分析结果

3．5 多重PCR方法的构建

3．6 荧光定量PCR方法的构建

3．7 灵敏性检测

3．7．1 模板浓度稀释检测

3．7．2 高温高压处理检测

3．7．3 多重PCR方法检测掺杂组织

3．8 山羊、绵羊定性定量检测方法的验证

3．8．1 多重PCR方法的验证

3．8．2 荧光定量PCR方法的验证

4 讨论

4．1 关于多重PCR方法的讨论

4．2 关于荧光定量PCR方法的讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢