NRPS-A在侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽生物合成中的功能分析

摘要

抗生素在被发现至今已被应用到生活的各个领域中，但抗生素的滥用也带来了一系列的问题，对于食品安全造成了严重的危害，因此对于新型的抗菌物质的寻找，以代替抗生素和解决抗生素残留问题是目前亟待解决的问题。
　　由侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）S62-9菌株产生的抗菌肽BBL，具有抑菌谱广、耐酸碱性、耐高温性等优点，并且不易残留、抗药性产生几率小的优点，在食品防腐剂和饲料添加剂的方面具有广阔的应用前景。目前有关侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的遗传信息、合成机制、免疫机制以及编码基因等方面相关的报道极少。侧孢短芽孢杆菌S62-9遗传信息定位在质粒上，已经完成了质粒的测序工作，得到了contigs。在contig4中发现了一个不完整的非核糖体肽合成酶NRPS-A基因。为了挖掘NRPS-A在抗菌肽BBL合成中的功能，本文通过TAIL-PCR技术获得NRPS-A的上游序列，通过基因簇序列分析和比对分析挖掘NRPS-A的功能以及其它功能基因，通过同源重组敲除的方式对NRPS-A基因进行敲除，验证该基因的功能。研究结果为探究NRPS-A基因在抗菌肽BBL合成中的功能提供基础，为编码基因的的解读与抗菌肽的合成途径的研究提供研究基础，也为利用基因工程的手段构建或改造抗菌肽BBL的高产菌株提供一个前提。现论文的主要研究结果如下:
　　TAIL-PCR扩增非核糖体肽合成酶通过TAIL-PCR对侧孢短芽孢杆菌S62-9的质粒基因组中的非核糖体肽合成酶NRPS-A基因的上游序列进行扩增，得到了4条扩增条带。经过DNAMAN比对后得到1条2.74kb大小的序列。序列分析后得到了NRPS-A基因、pp-binding基因以及一个ABC基因;基因比对后，contig5和contig4拼接成了一个完整的基因决定簇。完整的A结构域基因，编码524个氨基酸;1个pp-binding基因编码83个氨基酸。
　　生物信息学分析对拼接好的决定基因簇通过序列比对、同源性分析、底物特异性分析，基因簇分为合成、修饰、转运3个主要功能结构。同时将相关的基因进归类，分为合成结构BblG、转运结构BblF、以及其他的修饰结构。经过分析，合成相关结构由NRPS-A和pp-binding组成，属于一种非典型的非核糖体肽合成酶模块。NRPS-A是非核糖体肽合成酶中的腺苷化结构域，其特异性底物为缬氨酸，构建了NRPS-A蛋白的三维构象，推测它在抗菌肽BBL合成中负责识别并活化特异性的氨基酸;pp-binding基因是聚酮合酶中的酰基载体蛋白，负责接受活化的酰化氨基酸;BblF功能域由1个ATP结合区域，2个跨膜区域组成的ABC转运蛋白系统，负责抗菌肽BBL的转运。
　　NRPS-A敲除菌株的筛选与验证通过同源重组敲除的方法敲除NRPS-A基因的部分编码序列，随后的多步筛选得到了缺失突变体pAH-21和pAH-25。在PCR验证显示缺失突变体pAH-21和pAH-25已经完成敲除，敲除NRPS-A后菌株无抑菌圈的产生，说明NRPS-A基因与抗菌肽BBL的合成有直接关系。
　　本文通过TAIL-PCR扩增得到一个非典型的非核糖体肽合成酶，分析了NRPS-A基因在抗菌肽BBL合成中的功能，基因敲除试验表明NRPS-A与抗菌肽BBL合成具有直接的关系，为抗菌肽BBL的合成途径与合成机理的研究提供基础。

目录

声明

摘要

1．1 研究现状

1．1．1 抗菌肽概述

1．1．2 抗菌肽的合成

1．1．3 核糖体肽合成

1．1．4 非核糖体肽合成

1．1．5 非核糖体肽／聚酮杂合途径

1．1．6 侧孢短芽孢杆菌研究现状

1．2 目的意义

1．3 本研究的主要内容

1．3．1 主要研究内容

1．3．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 培养基和相关试剂的配置

2．1．4 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 质粒的提取

2．2．3 高效TAIL-PCR

2．2．4 PCR片段回收

2．2．5 片段连接、转化、验证、测序

2．2．6 序列拼接与基因分析

2．2．7 同源重组(融合PCR)引物设计

2．2．8 上、下同源臂片段的扩增

2．2．9 融合PCR扩增融合片段

2．2．10 融合片段的连接、转化、测序

2．2．11 敲除载体的构建

2．2．13 侧孢短芽孢杆菌S62-9感受态细胞的电击转化

2．2．14 敲除突变体的筛选及性状的验证

3 结果与分析

3．1 TAIL-PCR 5‘扩增结果

3．2 序列拼接及分析

3．3 决定基因簇结构特征分析

3．4 NRPS-A基因敲除

3．4．1 融合片段的扩增

3．4．2 敲除载体的构建

3．4．3 侧孢短芽孢杆菌S62-9感受态的制备

3．4．4 缺失突变体的筛选及性状的验证

4．1 抗菌肽BBL的生物合成

4．2 侧孢短芽孢杆菌S62-9的转化方法

5 结论

参考文献

作者简介

致谢