苹果病毒RT-PCR检测样本采集与保存方法的研究

摘要

苹果病毒病是一类影响范围极广的世界性病害，在我国各苹果产区普遍发生。目前，国内外尚无高效的防治药剂，严重制约了我国苹果产业的健康发展。繁育无病毒苗木、实施果园无毒化栽培可以大大降低苹果病毒病的发生几率，是防治苹果病毒病最为有效的措施。在许多发达国家已经实现了无毒化栽培，但在我国无毒栽培体系还不完善。病毒检测是繁育无病毒苗木的重要环节，决定着苗木无毒化的效率，目前，应用较为普遍的RT-PCR检测技术为苹果病毒的检测提供了有力工具，但受各方面条件的限制，一些苗木繁育基地还未能实现自行检测，需要寄送到相关部门协助完成病毒检测环节。本研究针对苹果苗圃寄送的样本，比较了两套优化好的RT-PCR检测体系的检测结果，发现存在明显差异，检测可靠性还有待进一步提高。因此，本研究从检测体系本身的灵敏度、采集样本的组织部位、采样季节、寄送样本方式、保存样本方式等多方面因素考虑，对苹果主要病毒RT-PCR检测方案进行优化，以提高病毒检测结果的可靠性，为实现果园无毒化栽培奠定基础。
　　本研究以携带苹果锈果类病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus，ApMV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)的苹果树为试材，比较了两套RT-PCR检测体系的灵敏度;选择灵敏度较高的RT-PCR检测体系，在不同月份采集苹果树不同组织部位进行检测，比较检测效果，明确病毒检测采取样本的适宜时期和组织部位;将样本采用枝条或枝皮粉末两种方式进行保存，比较两种方式保存后的检测效果，确定样本采集后适宜的处理方式;将样本置于不同温度，保存不同时间，比较保存后的检测效果，阐明田间待测样本适宜的寄送条件。主要研究结果如下:
　　1、明确了两套苹果主要病毒RT-PCR体系检测效果的差异。2017年9月24日自陕西千阳苗圃采集24个样本，分别寄送到两个机构，两个机构采用的RT-PCR检测体系分别为检测体系Ⅰ和检测体系Ⅱ，在7天内对ACLSV、ASPV、ASSVd、ASGV4种病毒进行检测，检测体系Ⅰ几种病毒的检出率为:29.2％、20.8％、25％、50％;检测体系Ⅱ检出率为:4.1％、37.5％、20.8％、29.2％，两套RT-PCR检测体系检测结果差异较大。
　　2、比较了两套RT-PCR检测体系的灵敏度。采用同一带毒的组织样本，提取总RNA，进行梯度稀释，分别测定检测体系Ⅰ和检测体系Ⅱ的灵敏度，结果表明:检测体系ⅠASSVd、ACLSV、ASPV、ASGV4种病毒灵敏度分别达到0×10-6、0×104、1×10-6、0×10-6;检测体系Ⅱ的灵敏度分别是1×10-5、1×102、0×10-6、0×10-6。表明检测体系Ⅰ对4种主要病毒的检测灵敏度更高。
　　3、苹果主要病毒RT-PCR检测取样适宜部位和时期的确定。本研究以携带ASSVd、ACLSV、ApMV、ASPV、ASGV的苹果树为试材，对2017年4月到2018年3月果树不同时期的一年生上层枝皮、中层枝皮、下层枝皮、上层叶片、中层叶片、下层叶片、叶脉、果皮、果肉、种子和根系进行RT-PCR检测，结果表明:多数苹果病毒在5-8月份各组织部位的检出率偏低，多数苹果病毒的检测不宜选择果肉和种子，检测结果不可靠。ASSVd、ACLSV、ApMV、ASPV检测的适宜时期为10月份，冠层下部一年生枝条枝皮为最佳检测部位，ASGV的适宜检测时期为4月份，最佳检测组织部位为冠层上部一年生枝皮。在方便采集的时期，根系也可作为各病毒检测的组织部位。
　　4、苹果主要病毒RT-PCR检测取样适宜部位和时期的确定。选择带有ACLSV、ASSVd两种病毒的苹果样本为试材，保存前采用不同的方式处理，然后在不同的温度下保存不同的时间，比较检测效果。(1)样本保存前处理方式:将枝条用报纸包裹保存或刮取枝皮粉末锡箔纸包裹保存两种方式。在20℃下保存0d、3d、5d、7d后，RT-PCR检测ASSVd和ACLSV，结果表明:枝条保存的检测效果优于枝皮粉末。(2)保存温度和时间:将样本置于0℃、4℃、25℃、37℃分别保存0d、0d、3d、5d、7d、10d、15d，利用RT-PCR进行检测，结果表明:样本保存适宜温度为4℃、25℃，3d内可保证5种病毒的检测可靠性，5d内保证除ApMV其它4种病毒的检测可靠性。(3)样本寄送后续保存方式:将待测样本在4℃、25℃保存3天后，移至-80℃保存10d、20d后RT-PCR检测，检出率均为100％。因此，苹果病毒样本应以枝条的方式直接寄送或保存，寄送或保存应为4℃、25℃，寄送3-5d后，样本可放入-80℃超低温保存，以保证后期检测结果的可靠性。
　　5、明确了国家苹果产业技术体系河北农业大学实验园苹果主要病毒的发生情况，分析了苹果锈果病的田间扩散趋势。148株苹果树ASSVd、ACLSV、ApMV、ASPV、ASGV的检出率为39.2％、23.3％、39.2％、27.7％和16.9％。苹果锈果病检出率由2015年的21.6％上升为2017年的27.6％，显症率由2015年的10.1％上升为2017年的16.2％。苹果锈果类病毒的发生有逐年上升的趋势，发病果树比较集中。

目录

声明

摘要

1引言

1．1苹果病毒病的研究现状

1．2苹果几种主要病毒的症状特点

1．2．1苹果锈果类病毒

1．2．2苹果花叶病毒

1．2．3苹果褪绿叶斑病毒

1．2．4苹果茎痘病毒

1．2．5苹果茎沟病毒

1．3苹果几种主要病毒的侵染与传播途径

1．4苹果病毒病的防治措施

1．5苹果无毒苗木的生产现状

1．6苹果病毒常用检测技术

1．6．1生物学检测

1．6．2电子显微镜技术

1．6．3血清学检测

1．6．4分子生物学技术检测

1．7本研究的目的和意义

2．1供试植物材料

2．2主要药品试剂和仪器

2．2．1主要试剂

2．2．2主要仪器

2．3植物总RNA的提取

2．3．1检测体系Ⅰ总RNA的提取

2．3．2检测体系Ⅱ总RNA提取

2．5 RT-PCR体系及程序

2．5．1检测体系ⅠRT-PCR体系及程序

2．5．2检测体系Ⅱ RT-PCR体系及程序

2．6苹果主要病毒两种检测体系的比较

2．7苹果主要病毒两种RT-PCR检测体系灵敏度的测定

2．9．2样本寄送或保存适宜温度、时间的测定

2．9．3样本寄送后续保存方式的测定

2．10苹果主要病毒病田间发生情况的调查和检测

3结果与分析

3．1苹果主要病毒两种RT-PCR检测体系检测效果的比较

3．2苹果主要病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．2．1苹果锈果类病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．2．2苹果褪绿叶斑病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．2．3苹果花叶病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．2．4苹果茎痘病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．2．5苹果茎沟病毒RT-PCR检测的适宜时期和组织部位

3．3苹果病毒样本RT-PCR检测的适宜保存条件

3．3．1样本保存前处理方式的确定

3．3．2样本寄送过程中保存温度、时长的确定

3．3．3样本寄送后续保存方式的确定

3．4苹果主要病毒的田间发生情况

3．4．1国家苹果产业技术体系河北农业大学实验园病毒病发生情况

3．4．2苹果锈果病田间扩散趋势的调查

4讨论

4．3苹果病毒RT-PCR检测样本适宜保存条件的确定

4．4 ASSVd田间扩散趋势

5结论

参考文献

作者简介

致谢