孕酮干预ATP诱导SH-SY5Y细胞损伤的膜孔机制

摘要

目前认为三磷酸腺苷(Adenosine-5'-triphosphate，ATP)是神经系统中重要的信号分子之一，P2X7受体(P2X7R)是介导ATP毒性作用的主要受体，生理浓度（微摩尔水平）下，ATP激活P2X7R形成阳离子通道，可非选择性地介导Ca2+、Na+内流，K+外流等，参与一系列生理作用，如调节递质释放、修饰突触和营养神经等作用[1-3]。然而，胞外高浓度ATP反复刺激P2X7R则可以形成“膜孔”，允许各种阳离子及NMDG+、YO-PRO-1等900D以下的大分子物质通过[4,5]，产生细胞毒性作用，引起细胞凋亡、坏死。有研究显示，在脑损伤中，P2X7R过度活化可以增加细胞外Ca2+内流，诱发Ca2+超载[6]，加重脑组织损伤，介导神经元凋亡和坏死。 在中枢神经系统急性中毒性损伤、创伤性损伤、脊髓损伤、中风等动物实验中，应用孕酮（Progesterone）疗法可延缓模型动物的神经细胞坏死和凋亡，减轻炎症反应以及缺血性脑损伤导致的脑水肿，促进脑神经髓鞘的合成，促进血脑屏障重建[7-9]，并且能改善与年龄有关的痴呆（阿尔茨海默病）、降低癫痫等神经退行性病变的发生与发展[10-20]。至今脑损伤治疗仍是人类面临的极大难题，临床上缺乏理想的干预方法和手段，孕酮或许能为患者带来一丝希望。既然ATP浓度升高是多种中枢或外周神经元继发性损伤时的普遍现象，孕酮对神经元继发性损伤的保护作用也已得到证实。那么，研究孕酮调控P2X7R膜孔激活就具有特别的理论意义。本实验试图通过观察孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响，探讨孕酮神经元保护作用的机制，为其临床应用提供实验依据。 目的：观察高浓度ATP对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的影响，探讨孕酮抗ATP诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响及相关机制。 方法：1细胞存活率的测定 1.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，吹打成细胞悬液，以5×l04／mL的细胞密度种置在96孔培养板中，在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养24h，随机分为4组：(1)空白组：无细胞，只含培养基。(2)正常对照组：SH-SY5Y细胞常规培养，无ATP处理(0mM ATP)。(3)ATP组(分别用1、3、5、7mM ATP)。孵育2h后，以正常对照组的存活率为100%，CCK-8法检测该细胞在不同ATP浓度作用下的存活率。 1.2SH-SY5Y细胞实验处理方法同上，分为6组，正常对照组、ATP组、孕酮(10、30、100、300nM)+ATP组。孕酮预孵育30min，然后加入5mM ATP处理2h，使孕酮存在于整个反应体系中。以正常对照组的存活率为100%，CCK-8法测各组中的细胞存活率。 2检测SH-SY5Y细胞膜孔形成 2.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，吹打成细胞悬液后，以5×l04/mL的细胞密度种置于96孔培养板中，随机分组为：正常对照组、ATP组(l、3、5、7mM ATP)。ATP作用2h，将YO-PRO-1(2μM)加入该体系中孵育l h，经酶标仪检测各组的荧光强度。 2.2取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，以5×l04／mL的细胞密度培养于96孔培养板中，随机分组为：正常对照组、ATP组、ATP+KN-62(P2X7受体拮抗剂)组、ATP+孕酮组。其ATP为5mM，孕酮为30nM，KN-62为500nM。孕酮或KN-62先孵育30min后，ATP作用2h，将YO-PRO-1(2μM)加入该体系中孵育l h，经酶标仪检测各组细胞的荧光强度。 3Furo-3/AM检测细胞内游离Ca2+浓度 3.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，吹打成细胞悬液后，以5×l04/mL的细胞密度种置于96孔培养板中，随机分为4组：0、1、3、5mM ATP，各组均分别作用15、30、60min，Hank’s溶液洗涤3次，加终浓度含5μM Fluo3-AM和2μM Hoechst33342的无血清、无酚红H-DMEM培养液,37℃孵育30min。荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度变化。 3.2取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，吹打成细胞悬液后，以5×l04/mL的细胞密度种置于96孔培养板中，随机分为4组：正常对照组、ATP组、孕酮+ATP组、KN-62+ATP组。其ATP为5mM，孕酮为30nM，KN-62为500nM。孕酮或KN-62先孵育30min后，ATP作用2h，然后Hank’S洗涤细胞3次，加终浓度含5μM Fluo3-AM和2μM Hoechst33342的无血清、无酚红H-DMEM培养液，37℃孵育30min。荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度变化。 4SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的检测 取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞，随机分成3组：正常对照组、5mM ATP组、30nM孕酮+5mM ATP组。提取细胞膜蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，Western blotting检测SH-SY5Y细胞P2X7受体表达水平。 结果：1SH-SY5Y细胞存活率的测定 1.1不同浓度的ATP作用2h对SH-SY5Y细胞存活率的影响以正常对照组细胞存活率为100.0%，CCK-8法检测结果：1、3、5、7mM ATP组存活率分别为80.4%，71.7%，56.1%，36.2%，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。随胞外ATP浓度增高，细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖性。 1.2孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响以细胞正常对照组存活率为100.0％。ATP组细胞存活率为56.1％。3nM孕酮+ATP组、10nM孕酮+ATP组、30nM孕酮+ATP、100nM孕酮+ATP组细胞存活率分别为62.8%，64.6%，74.4%，59.7%，与单纯ATP组相比均有明显差异(P＞0.05)。孕酮在保护ATP诱导的SH-SY5Y细胞的损伤中具有浓度依赖性。 2检测SH-SY5Y细胞膜孔形成 2.1ATP诱导SH-SY5Y细胞膜通透性的变化以胞内YO-PRO-1荧光强度为指标，观察ATP对SH-SY5Y细胞通透性的影响。以对照组YO-PRO-1的荧光强度为100.0%，1、3、5、7mM ATP组分别是103.5%，108.6%，120.5%，140.6%，与对照组比较差异均有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），且表现出浓度依赖性的特征。 2.2孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞膜孔形成的影响荧光显微镜下观察胞内YO-PRO-1荧光强度，结果，5mM ATP组明显强于正常对照组，而孕酮(PROG)+ATP组和KN-62+ATP组荧光信号明显低于ATP组。多功能酶标仪检测也有类似结果，经孕酮或KN-62先作用于30min后，再给予ATP处理2h，细胞内的荧光强度分别为103.9％、98.23％，均明显低于ATP组120.5%(P＜0.01)，而与正常对照组无显著差别(P＞0.05)。 3孕酮对细胞内游离Ca2+浓度的影响 正常SH-SY5Y细胞在不同时间内钙离子含量及分布较稳定。随着ATP组作用的延长，平均荧光值的对数值逐渐增高，即胞内钙离子逐渐增高。孕酮(PROG)+ATP组和KN-62+ATP组与ATP组相比较，细胞内钙离子明显降低（P＜0.05）。 4孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的影响 5mM ATP处理2h后SH-SY5Y细胞P2X7受体蛋白表达明显增加（P＜0.05），而预先给予30nM孕酮(PROG)预孵育30min后，再加ATP作用2h，P2X7受体蛋白表达水平则显著低于ATP处理组(P＜0.05)。 结论：KN-62可以降低ATP介导的SH-SY5Y细胞对YO-PRO-1的摄入、胞内游离钙离子的上升、提高细胞存活率，说明P2X7受体在ATP诱导的SH-SY5Y细胞死亡中起着重要作用；孕酮有相似于P2X7受体拮抗剂“KN-62”的作用，能显著抑制ATP诱导的细胞膜孔形成，降低细胞内Ca2+浓度，提高细胞存活率。

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