明串珠菌乙酸激酶和葡聚糖蔗糖酶基因失活的研究

摘要

明串珠菌（Leuconostoc）是腌菜、韩国泡菜和德国泡菜等发酵蔬菜中的优势菌株，也是美国FDA认可的GRAS菌，不生产内毒素，能分泌特异性胞外蛋白且没有降解蛋白活性，所以明串珠菌是表达外源蛋白的很好的候选菌，在食品工业中具有巨大的应用价值。本课题分别失活了明串珠菌的乙酸激酶基因ack和葡聚糖蔗糖酶基因dts，得到相应的基因失活菌株，再与出发菌株进行生理生化特性对比，从而研究碳代谢的变化规律，为基因工程育种奠定了基础。
　　明串珠菌电转化的再现性差、效率稍低，因此本研究优化了电转化条件。以pCW4为载体，明串珠菌为受体菌，固定接菌量和氨苄浓度，优化了PBS溶液的pH、LiAc-DTT孵育时间、溶菌酶的量和孵育液中蔗糖浓度。利用MRS(含0.48μg/mL氨苄)培养明串珠菌(初始OD600为0.048)，OD600为0.5左右时收集菌体，用LiAc-DTT溶液(含100U/mL溶菌酶、0.5mol/L蔗糖)孵育20min，再用pH6.9的PBS洗涤和电转化，得到较高的转化率，为2.47×105 CFU/μg DNA。
　　为了揭示碳流和能量流在代谢网络中的走向，失活肠膜明串珠菌ack基因。运用PCR技术分别扩增ack的上、下游同源臂，构建具有四环素抗性标记的同源重组载体，导入到明串珠菌经两次交换，使肠膜明串珠菌的ack失活，并检测突变菌株与原始菌株的生理特性。PCR验证表明，突变菌株的扩增产物长度比原始菌株的大1200bp左右。与原始菌株相比，突变菌株的乙酸产量减少49.1％，乙醇产量增加8.3%，双乙酰产量减少16.3%。
　　甘露醇在食品工业和医药工业中有广泛应用，肠膜明串珠菌可以转化蔗糖生产甘露醇、葡聚糖和其他产物。为了提高甘露醇的产量，本研究通过失活肠膜明串珠菌dts阻断了葡聚糖的合成途径并研究了dts失活对甘露醇生产的影响。本研究对编码葡聚糖蔗糖酶的基因dts进行了克隆和测序。利用重叠延伸技术将dts基因的上游和下游同源臂连接在一起，再连接到pUC19上，获得同源重组载体pUC19-dts。将其导入肠膜明串珠菌，经过双交换，失活肠膜明串珠菌的dts基因，获得了不含抗性标记的dts失活菌株。发酵实验检测结果显示突变菌株的葡聚糖产量降低28.8%，甘露醇产量提高15.3%。

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第一章 绪论

1 .1 明串珠菌概述

1 .2 基因失活的方法

1.3 研究的目的、可行性和内容

第二章 明串珠菌的稳定高效电转化

2 .1 实验材料

2 .2 实验方法

2 .3 实验结果

2 .4 讨论

2 .5 小结

第三章 构建明串珠菌的乙酸激酶基因失活菌株

3 .1 实验材料

3 .2 实验方法

3 .3 实验结果

3 .4 讨论

3 .5小结

第四章 构建明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活菌株

4 .1 实验材料

4 .2 实验方法

4 .3 实验结果

4 .4 讨论

4 .5小结

第五章 结论

参考文献

附录A

附录B

致谢

攻读学位期间取得的相关科研成果