生物细胞内含磷代谢物及游离镁离子的核磁共振研究

摘要

核磁共振(NMR)方法作为一种无损伤检测方法正越来越广泛地应用于活细胞、组织器官，乃至整体动物和人体中复杂小分子化合物的体内变化研究，这种全新的无损伤方法也用来测定生物细胞内游离镁离子的浓度、细胞内pH值并取得了一定的进展。核磁共振测定生物细胞内游离镁离子的方法近年来多应用于临床医学、生物分析等方面。NMR方法可以无损伤地对细胞内游离Mg2+浓度进行测定，同时可以考察细胞的代谢情况，允许在较长时间内连续进行观察。核磁共振方法研究Mg2+一般有两种方法：31pNMR和19FNMR。目前31pNMR应用比较广泛，在研究Mg2+的同时可以对含磷代谢物等其它生理指标进行考察，还可以测定细胞内的pH，而且所研究的对象范围很广，包括离体器官、灌流心脏、悬浮细胞、贴壁细胞及血小板等。本文采用31pNMR对cos-7细胞、兔血小板和人血小板等样品进行了分析测定，并合成了19FNMR测定镁离子的指示剂5F-APTRA。本论文共包括4章。 第1章综述了利用核磁共振方法来考察生物细胞内含磷小分子代谢物以及游离镁离子浓度的研究现状。 第2章采用31PNMR方法考察了贴壁细胞、血小板的含磷代谢物以及细胞内pH。将培养的贴壁细胞cos-7在对数生长期进行收集，离心稀释成浓度大于108细胞/mL的细胞悬液，装进核磁共振管进行31pNMR的测定。然后对所得谱图进行分析，根据无机磷(Pi)的化学位移的变化测定细胞内的pH。兔血小板由抽取新鲜的兔血经离心得到，人血小板由医院提供。将两者分别进行31pNMR的测定，考察了其中含磷代谢物及其pH值。测得cos-7细胞和兔血小板的无机磷化学位移分别为4.69±0.06(n=3)和4.64±0.05(n=3)，pH分别为5.58±0.04和5.39±0.02。 第3章建立了31pNMR测定镁离子的方法，ATP与细胞内游离的镁离子结合，通过利用测量ATP中磷的α和β峰的化学位移差值，能精确确定MgATP和整个ATP的比值，而不需要在细胞样品与对照组中加入内标来确定化学位移。根据模拟细胞内离子强度和酸度等条件下MgATP的解离常数KDMgATP，能计算出游离镁离子的浓度。 第4章建立了19FNMR测定镁离子的方法并进行了5F-APTRA指示剂的合成：原料2，4-二氟硝基苯经过与氢氧化钾反应生成5-氟-2-硝基酚，然后催化氢化生成5-氟-2-氨基酚，再与溴乙酸甲酯在质子吸收剂作用下酯化，得到5F-APTRA指示剂。对合成5F-APTRA指示剂的原料及所需试剂进行了合成：5-氟-2-硝基酚，质子吸收剂1，8-二(二甲氨基)萘，乙酸溴甲酯；进而合成5F-APTRA指示剂并对各产物进行了结构鉴定。 核磁共振是一种可以在无损伤情况下连续测定细胞内代谢情况的方法，本论文所得到的这些信息可以为考察细胞内代谢情况等提供重要的依据。

目录

文摘

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第1章综述31P和19F NMR测定pH和Mg2+的应用研究

第2章31P NMR方法研究生物样品中的含磷代谢物

第3章31P NMR方法测定生物细胞内游离镁离子

第4章19F NMR测定细胞内镁离子

摘要

前言

4.1原理

4.2所需原料的合成

4.3 5F-APTRA的合成

讨论

参考文献

缩略词表

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致谢