小鼠骨髓间充质干细胞中AC基因亚型的表达及AC3对其纤毛长度的影响

摘要

骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs),也称骨髓基质来源干细胞，是存在于骨髓中的一类具有多向分化潜能的干细胞，可分化为成骨细胞、骨骼肌细胞及脂肪细胞等，参与体内骨平衡调节和骨造血微环境构成。腺苷酸环化酶（ Adenylyl cyclase，AC）作为第二信使cAMP信号通路的重要组分，在BMSCs的成骨/成脂分化中具有重要作用，但BMSCs中AC亚型表达种类，尚待明了。初级纤毛（Primary cilia）是一种突出于真核细胞表面的“毛发状”细胞器，是原生生物到脊椎动物中一种在进化上高度保守且必不可少的细胞器，具有感测和转导机械力和化学信号并产生信号级联反应等功能，对BMSCs细胞增殖与分化具有关键作用。AC3不仅在哺乳动物主要嗅觉表皮组织神经细胞的初级纤毛介导的嗅觉信号传导过程中具有重要调节作用，还与BMSCs中的初级纤毛共表达。但AC3是否影响BMSCs中细胞纤毛长度进而影响BMSCs的增殖与分化，尚未明确。
　　本研究通过对小鼠BMSCs原代培养条件优化，发现小鼠BMSCs原代培养在以4.0×106cell/mL的骨髓单核细胞浓度培养，并于4d首次换液，增殖速度快，生长状态良好。对最适培养条件下生长良好的的细胞，提取其总RNA并反转录；采用RT-PCR和序列比对分析，确定了在原代小鼠BMSCs中有6种AC亚型表达，分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9；分别对野生型小鼠骨髓间充质干细胞（WT-BMSCs）和AC3基因敲除型小鼠骨髓间充质干细胞（MUT-BMSCs）进行体外培养、饥饿诱导和LiCl刺激，利用细胞免疫荧光染色对初级纤毛进行亚定位及长度统计分析。相同体外培养条件下，相较于WT-BMSCs细胞，MUT-BMSCs细胞增殖速度相对较慢；同时，体外诱导条件下，WT-BMSCs细胞初级纤毛长度最长为8.96μm，MUT-BMSCs细胞初级纤毛长度最长为5.61μm，MUT-BMSCs细胞初级纤毛长度明显短于WT-BMSCs细胞初级纤毛长度。本研究明确了原代小鼠BMSCs中AC亚型表达种类分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9，并首次发现小鼠AC3基因缺失可导致其BMSCs纤毛长度变短。

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引 言

第1章 文献综述

1．1 骨髓间充质干细胞

1．2 初级纤毛

1．3 腺苷酸环化酶

1．4 本研究的目的和意义

第2章 小鼠BMSCs中的AC基因家族表达

2．1 前言

2．2 试剂和溶液

2．3 实验动物

2．4 方法

2．5 结果

2．4 讨论

第3章 小鼠BMSCs中腺苷酸环化酶Ⅲ对初级纤毛长度的影响

3．1 前言

3．2 相关仪器、试剂及实验材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

结 论

参考文献

致谢

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