大豆疫霉菌基因芯片检测技术研究

摘要

大豆疫病(Phytophthorasojae)是严重危害大豆生产的毁灭性病害。该病1948年首先在美国发现，目前已传播至数十个国家，广泛分布于世界上大部分大豆产区，每年对全球的大豆产业造成的损失高达10亿美元。近年，大豆已经成为我国进口量最大的农产品，我国每年进口大豆1000～2000万吨，金额达数十亿美元，几乎相当于我国大豆的产量。其中进口量最高的国家是美国，其次是阿根廷和巴西。我国自1986年起将大豆疫病列为对外检疫对象。　　本研究应用基因芯片这一高通量检测技术对大豆疫霉菌及其相关种，包括：烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、苎麻疫霉(Phytophthorabochmeniae)、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)、大豆霜霉(Peronosporamanschurica)、大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、群结腐霉(Pythiummyriothlum)、侧雄腐霉(Pythiumparoecandrum)共10个种27个菌株开展了研究。　　在研究中，通过对大豆疫霉菌及其相关种DNA序列的查找、比较与分析；进而对大豆疫霉菌及其相关种通用引物、大豆疫霉菌特异性探针及大豆疫霉菌及其相关种通用探针进行设计与合成，在此基础上，制备了大豆疫霉菌检测基因芯片。在大豆疫霉菌基因芯片的检测中，对大豆疫霉菌及其相关种通用引物应用单重PCR、双重PCR、三重PCR进行筛选，并进行了反应体系的优化；在基因芯片杂交前，进行了基因芯片杂交条件的筛选；应用筛选出的三重PCR体系对大豆疫霉菌及其相关种进行扩增，在优化后的杂交条件下进行了大豆疫霉菌特异性探针和大豆疫霉菌及其相关种通用探针的特异性和稳定性实验；大豆疫霉菌及其相关种基因芯片检测技术的灵敏度实验及单个孢子基因芯片检测实验。　　通过研究，自行设计和合成了大豆疫霉菌基因芯片检测探针44条、引物10对，从中广泛筛选出大豆疫霉菌检测特异性探针7条，大豆疫霉菌及其相关种检测通用探针2条，通用引物3对。首次建立了大豆疫霉菌基因芯片检测的三重PCR体系，和相应的检测程序。优化出大豆疫霉菌基因芯片检测杂交温度和杂交液，最佳温度为42℃，最适杂交液的配方为：5×SSPE、2％SDS。在此基础上，首次建立了大豆疫霉菌基因芯片检测方法。该方法特异性强，所制备的芯片能特异性地检测大豆疫霉菌；灵敏度高，为达0.2pg/μL；低通量，能对大豆疫霉菌不同基因的多个物种特异性DNA片断或多个碱基位点进行一次性同时检测；能对大豆疫霉与其他菌在一些DNA片断中仅存在单个碱基差别的检测。本研究还对大豆疫霉菌单个卵孢子基因芯片检测方法进行了探索研究，初步建立了单个卵孢子基因芯片检测方法，使国境口岸在截获一个至少量卵孢子的情况下，也能开展对大豆疫霉菌的检测。　　本研究所建立的大豆疫霉菌基因芯片检测方法与传统土壤诱集所进行的形态学鉴定方法相比，检测时间明显缩短，从25天左右，缩短至一周，如从土壤中直接发现卵孢子，则可缩短至2～3天；与常规PCR方法相比，该方法灵敏度更高；与实时荧光PCR方法相比，同时检测的目标DNA片段更多，结果更可靠。而单个卵孢子检测方法适合于口岸截获少量孢子时使用。大豆疫霉菌的基因芯片检测方法无论在田间还是在国境口岸对大豆疫病菌的检测均具有推广应用价值。该方法也为搭建疫霉属真菌基因芯片检测平台方法的建立奠定了基础。

目录

摘要

缩略词及中英文对照

1前言

1.1大豆疫病及大豆疫霉菌检测方法的研究进展

1.2基因芯片技术及在检测上的研究进展

1.3研究目的及意义

2材料与方法

2.1大豆疫霉菌检测基因芯片的制备

2.1.1材料、试剂以及主要仪器

2.1.2方法

2.2大豆疫霉菌基因芯片检测

2.2.1供试材料

2.2.2.主要试剂

2.2.3主要仪器

2.2.4方法

3结果与分析

3.1大豆疫霉菌检测基因芯片的制备

3.1.1大豆疫霉菌及其相关种DNA序列的比较与分析

3.1.2大豆疫霉菌及其相关种基因芯片检测引物和探针的设计

3.1.3基因芯片探针浓度的测定

3.1.4基因芯片的制备

3.2大豆疫霉菌基因芯片检测

3.2.1单重PCR反应条件优化

3.2.2双重PCR反应条件的优化

3.2.3三重PCR反应条件的优化

3.2.4探针杂交条件的优化

3.2.5探针特异性和稳定性实验

3.2.6基因芯片检测灵敏度实验和检测结果的验证

3.2.7单个孢子基因芯片检测实验

4讨论与结论

4.1讨论

4.1.1大豆疫霉菌基因芯片检测方法的应用价值

4.1.2大豆疫霉菌基因芯片检测技术实验材料的选择

4.1.3基因芯片探针的设计

4.1.4多重PCR的影响因素

4.1.5基因芯片杂交反应的影响因素

4.1.6大豆疫霉菌基因芯片检测技术灵敏度实验和单个孢子检测实验

4.1.7基因芯片技术在实际应用中存在的问题和发展趋势

4.2结论

致谢

参考文献：

附录：已发表文章

图版1

图版2

图版3

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