猪源多杀性巴氏杆菌分离物荚膜PCR分型与毒素研究

摘要

目的：2003～2008年期间，贵州省相继出现了疑似猪萎缩性鼻炎的病例，为了对这些疑似病例进行确定性诊断，鉴定不同 Pm致病菌株的产毒素特征，调查贵州省是否存在危害更为严重的进行性萎缩性鼻炎。本项试验对猪源 Pm分离物的亚种分布、药物抗性、荚膜 PCR分型和产毒素特征进行深入研究，综合评价血清学反应、生物学试验和分子病原学检测技术对猪萎缩性鼻炎研究的学术意义和应用价值。
　　方法：从贵州省15个疑似猪萎缩性鼻炎发病猪场采集267份鼻腔棉拭子及肺脏病料，通过传统细菌学检查进行Pm的分离与鉴定；基于Pm分离物的生化反应特征，调查不同亚种的分布和药物抗性；基于Pm不同血清型菌株荚膜多糖成分的差异，采用对流免疫电泳技术对猪源 Pm分离物进行血清型鉴定；基于KMT基因是 Pm种的特异性 DNA片段，而荚膜生物合成位点 hya D、beb D、dcb F碱基序列分别对 A、B和D型是高度特异性的基因，研究 Pm种的分子生物学鉴定与荚膜 PCR分型；基于Pm产生皮肤坏死毒素的生物学活性，采用豚鼠皮肤坏死试验检测 Pm分离物产毒素的特征和进行病理组织学观察；针对猪萎缩性鼻炎 Pm菌株的toxA基因选择不同引物，鉴别 T+Pm与T-Pm分离物，同时完成 toxA全基因的克隆、测序及生物信息学分析。
　　结果：267份鼻腔棉拭子及肺病料中，分离到 Pm17株，分离率为6.37％（17/267）。Pm分离物的形态、结构、染色反应、培养性状和生化反应测定结果，与分子生物学PCR种特异性的鉴定一致。基于17株 Pm分离物的生化反应特征，10株属于Pm多杀亚种（P.multocida subsp.multocida）；7株属于Pm败血亚种（P.multocida subsp.septica）。不同来源、不同亚种Pm分离物的药物敏感性差异不显著。在17株Pm分离物中，8株鉴定为A血清型，占47.06％（8/17）；9株鉴定为D血清型，占52.94％(9/17)；未发现B血清型菌株。17株 Pm分离物通过豚鼠皮肤坏死试验与toxA基因 PCR方法检测，确定4株为T+Pm，检出率达到23.53％（4/17）。对豚鼠皮肤坏死组织进行病理切片观察，真皮深层、皮下组织和肌层均可见大量红细胞；毛囊上皮细胞发生核碎裂或核溶解，形成空泡；背部皮下横纹肌肌纤维间有大量红细胞。将贵州 T+Pm分离菌株的toxA全基因克隆与测序，toxA全基因分子长度为3858bp，编码1285个氨基酸，与国内外 T+Pm分离株的相应序列作比较；核苷酸序列的同源性达到99.7～99.9％；氨基酸序列同源性达到99.4～99.8％。结果表明Pm分离物的toxA基因具有高度保守性。
　　结论：本项试验证实了通过对流免疫电泳技术可以鉴定 A血清型或 D血清型猪源 Pm分离物；对 T+Pm、T-Pm分离物的全菌悬液和毒素滤过液进行了比较研究，深入认识到在猪萎缩性鼻炎的病例中，T+Pm产生的外毒素是导致鼻甲骨损害、萎缩、甚至消失的主要毒力因素；针对 toxA基因采用PCR方法检测 Pm分离物的产毒素特征，首次证实了贵州省养猪场中存在危害更为严重的进行性萎缩性鼻炎；研究期间在美国NCBI上登陆了Pm分离物的8个基因序列。这些研究成果丰富了猪源多杀性巴氏杆菌的基因资源，对猪萎缩性鼻炎的诊断、防制和净化具有应用价值。