脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究

摘要

目的：探讨脂质体介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染神经干细胞的最佳条件，转染的NSCs移植入正常大鼠侧脑室后，EGFP作为神经干细胞示踪剂的效果，为NSCs作为基因治疗载体提供实验依据，同时为转染其它功能基因奠定基础。 方法：(1)从胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海马中分离NSCs，采用NSC克隆悬浮法，选用无血清DMEM/F12培养液，添加剂B27，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮细胞生长因子(EGF)进行体外扩增培养，采用免疫细胞化学法检测NSC标志物Nestin的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2，3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达。(2)胎鼠神经干细胞离体后存活时间研究：在下列时间点进行原代培养：37℃组：1/2，1，2，3，4h；4℃组1/2，1，2，3，4天，观察细胞生长状态。(3)检测脂质体、质粒不同剂量下、脂质体-质粒复合物不同作用时间下、不同细胞传代次数下EGFP转染NSCs的转染效率。G418对阳性细胞筛选，观察细胞生长情况。将筛选阳性的细胞进行传代及诱导分化的观察，免疫细胞化法鉴定。MTT法检测转染前后NSCs的活力。(4)将筛选后的NSCs立体定向仪移植入大鼠侧脑室，分别移植后4W，8W，12W，15w，行大鼠脑组织冰冻切片制作，荧光观察。 结论：(1)从大鼠海马中分离培养出具有自我更新和多分化潜能的细胞，该类细胞属于中枢神经系统的NSCs，低温下更易生长，是进行转染的良好细胞模型；(2)脂质体可较为高效转染NSCs，移植到脑内能有效的表达，且可在脑内迁移，与脑组织整合，EGFP是NSC有效的示踪方法，进一步证实NSCs是一种理想的基因治疗的靶细胞，为转染其它功能基因奠定了基础。

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论文说明：英文缩写

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摘要

第一部分大鼠海马神经干细胞的体外培养的研究

前言

材料

方法

实验一结果

实验二结果

讨论

参考文献

附图

第二部分脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的研究

前言

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 神经干细胞在中枢神经系统疾病基因治疗中作用研究进展

致谢