整合微阵列数据筛选肺腺癌相关长链非编码RNA及LINC00968在其中的表达研究

摘要

目的：非小细胞肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因，最常见的恶性肿瘤之一，其5年总生存率仍低于15％，而早期发现能明显降低死亡率。无论是病理研究还是分子机制层面的研究均确认肺腺癌是非小细胞肺癌中主要亚型。而找出并应用可靠的肺腺癌相关的分子标志物可能是其早期诊断的关键。近期有研究发现基因组中至少90％被转录，但其中编码蛋白基因只占2％，大部分转录本是非编码RNA。而新的证据表明，非编码RNA可能在许多生理过程中发挥着重要的生物学作用。非编码RNA可以分为小RNA和长链RNA，而后者是指长度大于200bp的非编码RNA。其被研究证实参与各种类型细胞的增殖、分化、染色体沉默、组蛋白修饰等生物学过程，且它的异常表达在包括肺癌、肝癌、前列腺癌在内的多种类型的癌症中发现，其中HOTAIR、MALT1等长链非编码RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)被发现与肺癌细胞的增殖、凋亡等密切相关。然而虽然研究确认了大量的lncRNA，但是这些lncRNA中哪些与肺腺癌有关，其在肺腺癌发生发展中的作用和机制是什么并不十分清楚。本课题旨在从已公开发表的微阵列数据集中挖掘筛选可能与肺腺癌发生发展密切相关的lncRNA，并通过实验进行表达水平验证和细胞系筛选，为进一步研究这些lncRNA与肺腺癌发生发展的关系和作用机制以及开发新的分子诊断和治疗方法提供研究思路和依据。
　　方法：1、运用一种芯片探针集重注释方法重注释Affymetrix U133 Plus2.0芯片，筛选出lncRNA探针集。2、运用两种微阵列数据分析方法结合新的数据分析策略分析肺腺癌vs.非癌肺组织微阵列芯片数据，筛选出可能影响肺腺癌发生发展的lncRNA，且通过结合分析不同非小细胞肺癌亚型微阵列数据集，筛选出可能与肺腺癌特异相关的lncRNA。3、从数据分析结果中选择明显差异的7个lncRNA，采用荧光定量PCR(quantitativereal time PCR，qRT-PCR)方法检测其在10对肺腺癌组织及配对的癌旁组织中的表达丰度，验证其表达差异;4、选择其中两个在组织中明显差异表达的lncRNA采用qRT-PCR检测其在多个细胞株(16HBE、A549、NCI-H1299、NCI-H460)中的表达丰度，并计算其在A549、NCI-H1299、NCI-H460细胞株相对于正常人支气管上皮细胞株16HBE的相对表达量。
　　结果：1、通过对Affymetrix U133 Plus2.0芯片注释文件的重注释确定了芯片中包含有2935个lncRNA探针集;2、按照筛选原则从GEO数据库中筛选得到了符合要求的数据集5+4套，分别用于肺腺癌vs.非癌肺组织和肺腺癌vs.肺鳞癌的比较分析2、采用两种微阵列数据集整合方法（effect size和rank products）和新的分析策略分析从GEO数据库中筛选出5+4的Affymetrix U133 Plus2.0系列芯片非小细胞肺癌数据集，确定了可能与腺癌发生发展密切相关的lncRNA29个。可能与肺腺癌特异相关的lncRNA3个。本课题选取其中7个lncRNA验证其在肺腺癌组织中的表达水平，分别为LINC00968、RP11-38P22、LOC100505989、LOC100505495、LOC731424、LOC145837、LOC255480，发现均明显下调，与数据分析结果一致，其中LINC00968和RP11-38P22在肺腺癌组织中表达丰度明显低于配对癌旁组织（P值分别为8.47E-17和6.44E-18），均有统计学意义。而LINC00968在A549中亦明显下调（P值为1.58E-04），在其它细胞株未检测到表达，RP11-38P22在A549中未检测到表达，而在NCI-H1299和NCI-H460中明显上调（P值分别为1.25E-05和7.08E-06），均相对于正常人支气管上皮细胞16HBE。
　　结论：1、通过重注释Affymetrix U133 Plus2.0注释文件从而得到的2935个lncRNA，说明重注释芯片注释文件挖掘新的有价值的信息是可行的;2、通过结合两种整合分析方法从而筛选到了具有特异性的在肺腺癌中异常表达的3个lncRNA，提示这些lncRNA可能在肺腺癌的发生发展中发挥着重要作用，可能成为重要的药物靶点和临床诊断和预后预测标志物，也在一定程度上说明了分析策略和方法的有效性。3、LINC00968在肺腺癌组织中明显下调，提示LINC00968在其中可能发挥着抑癌作用，而lncRNA通常通过调控下游mRNA、microRNA的表达以及表观遗传修饰而发挥作用，它的明显下调可能意味着其突变的发生，而增加其表达量可能能够起到治疗肺腺癌的作用，其表达对肺腺癌的治疗及预后具有重要潜在价值，可能作为肺腺癌的一个新的治疗靶点。本课题组将继续在不同的层面验证此lncRNA在肺腺癌发生发展中的作用及机制。

目录

声明

主要中英文缩写

摘要

第一章 生物信息学方法筛选影响肺腺癌发生发展的长链非编码RNA

1 研究背景

2实验方法

2．1 数据检索

2．2 数据处理

3 实验结果

3．1 微阵列芯片重注释结果

3．2 腺癌VS．非癌肺组织整合分析结果

3．3 肺腺癌VS．肺鳞癌整合分析结果

3．4 两者整合后结果

4 讨论

5 结果与展望

第二章 LINC00968和RP11-38P22在肺腺癌组织及细胞系中的表达

1 材料与方法

1．1 知情同意

1．2 标本收集与处理

1．3 细胞株培养

1．4 实验试剂

1．5 实验仪器

1．6 qRT-PCR测LINC00968和RP11-38P22在肺腺癌组织中的表达

1．7 实验数据处理

1．8 统计学分析方法

2 结果

2．1 标本收集结果

2．2 qRT-PCR验证肺腺癌组织和癌旁肺组织中目标lncRNA的表达

3 讨论

4 结语与展望

参考文献

综述

致谢

攻读硕士学位期间已发表的论文