广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究

摘要

研究背景：
　　HBV属于嗜肝病毒科，是一种长3.2kb的DNA病毒，其为有包膜的环状不完全双链DNA。HBV是已知可感染人体的最小的双链DNA病毒，但其复制效率最高。它包含4个部分重叠的开放读码框（ORF），preS1/S2/S，preC/C，P和X。由于HBV聚合酶缺乏校准功能，导致HBV有很强的序列异质性。核苷酸异质性大于8％是HBV分型的原则，按照此原则HBV可以被分为8个基因型：A-H，新发现的基因型I和J还存在争议（未被NCBI在线基因分型工具收录）。
　　急慢性肝炎，肝硬化和肝癌的发生都与HBV感染紧密相关，严重影响人类健康。HBV是人体中最常见的病原体，全球有20亿人既往感染或现症感染。其中2千5百万人有慢性乙肝。超过75%的乙肝病人生活在西太平洋和东南亚。中国是HBV感染高发区，有1千2百万乙肝病人，其中大约有15%-40%发展成HBV相关肝硬化和肝癌。每年有大约60万人死于此类疾病。HBV在中国的分布：北方地区以C型为主，中南地区以B型为主，西南地区B型和C型均等，C/D重组基因型主要分布在西北地区，C2和B2是最多见的亚型。在我国农村，恶性肿瘤中胃癌死亡率最高，其次是肝癌；在城市，肝癌死亡率仅次于肺癌和胃癌死亡率，居第三位，因此其病原生物学、发病机制及预防和治疗是研究的重点内容。
　　广西扶绥地区的肝癌发病率和死亡率均超过50/10万，远高于全国平均水平27/10万。而广西桂林地区肝癌发病率约为29/10万，与全国水平接近。本课题组既往研究发现HBV感染、黄曲霉毒素的摄入和饮用水源污染等是广西扶绥县肝癌发生的主要三大环境危险因素，在黄曲霉毒素的摄入和饮用水污染得到控制后，扶绥县肝癌仍持续高发。目前HBV基因型、亚型以及变异成为其致癌作用研究的重点。为了了解扶绥地区HBV的生物学特征，现选取肝癌低发区桂林的HBV感染者和肝癌患者一同进行对照研究，预期从病毒学角度发现导致扶绥肝癌持续高发的根本原因。
　　目的：
　　（1）建立适用于多种HBV基因型的PCR反应体系并优化其反应条件，实现对广西壮族自治区内存在的各个基因型HBV全序列的高灵敏度扩增，并确保反应的特异性，为后续测序工作打下基础。
　　（2）对扶绥地区和桂林地区感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及携带者，通过PCR产物直接测序的方法，获得其血清中HBV序列信息，再使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接，获得HBV全序列。并使用进化树的方法对全序列进行分型和确定亚型。研究肝癌组和非肝癌组病人HBV突变情况，确定HBV感染相关肝癌的独立危险因素。
　　（3）对扶绥和桂林地区可能存在的特有基因型进行分析鉴定。
　　方法：
　　（1）通过文献检索和使用引物设计软件，找到适用于大多数HBV基因型的PCR引物，验证引物的特异性。同时比较一片段法和两片段法PCR在HBV全序列扩增中的效果差异，从而选择最优化的方法，确定PCR反应体系和反应条件，使用经荧光定量PCR准确测出HBV DNA含量的标本验证该PCR反应体系的检测灵敏度。
　　（2）收集来自扶绥地区和桂林地区的肝癌和慢性乙肝患者及HBV携带者血清，使用两片段法结合半巢式PCR，扩增HBV全基因，使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接，获得HBV全序列。并使用NCBI的在线分型工具和分子进化树的方法对全序列进行分型并确定亚型。按照基因分型分别研究肝癌组和非肝癌组病人的HBV突变情况，使用SPSS进行比较分析，找出肝癌相关突变位点；使用多因素统计分析，确定独立危险因素，并确定这些突变位点用于肝癌诊断的灵敏度和特异性，并尝试进行联合诊断分析。
　　（3）对基因分析得到的重组序列，使用NCBI的BLAST功能找到与重组序列相似的序列，查找文献原文，了解其分布情况。使用SIMPLOT确定重组位点，找出重组序列来源；分析其全序列与不同基因型标准序列的差异情况、以及S区氨基酸表达情况，确定重组基因型的分类。
　　结果：
　　（1）通过对30例临床标本的检测发现：两片段法的检测灵敏度远高于一片段法，HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的标本均可以检出明显的产物条带。故在后续实验中确定使用两片段法进行PCR扩增。同时，将本实验用到的引物序列与HBV标准序列进行匹配验证，证明其具有很好的特异性和较强的结合能力。此外，半巢式PCR方法的使用，既提高了检测灵敏度，又避免了非特异性产物的出现。
　　（2）本研究共收集来自扶绥和桂林地区的血清标本共339例，按照实验流程去除资料不全，HBV DNA含量过低及测序失败的病例后，共有187例研究对象测得HBV全基因序列。经NCBI基因分型工具鉴定分型，获得本地区HBV B型和C型的参考序列。扶绥地区的受试者中，C基因型占77.1%，B基因型占18.8%，重组基因型占4.2%。桂林地区的标本中C基因型占21.8%，B基因型占78.2%。两地HBV基因型分布存在显著差异。在全部受试者中，HBV B型有86例，其中B2占88.4%（75/86），B4占11.6%（11/86）；HBV C型有93例，其中C1占69.9%（65/93），C2占9.7%（9/93），C5占20.4%（19/93）。扶绥地区以C1，C5亚型为主，B2，C2，B4次之。桂林地区以B2占绝对多数，C1，C5，B4，C2次之。多因素统计分析结果显示：男性，年龄大于50岁，HBV C基因型感染分别是HCC发病的独立危险因素。将全部研究对象按照基因型分组，分别研究肝癌组和非肝癌组的HBV全基因序列，将超过10%的研究对象出现突变的位点定义为突变热点。B型有147个突变热点，C型有249个突变热点，将这些突变位点分为肝癌组和非肝癌组进行研究和分析，B型中有20个位点有统计学差异，C型有17个位点有统计学差异。经过多因素统计分析，在C基因型中发现3组位点突变（T53C，A1762T/G1764A，G1775A）是肝癌发生的独立危险因素，三者联合诊断将有助于提高诊断效能。
　　（3）本课题组发现编号为414，441，533，678的四例标本经NCBI基因分型工具确定为A，C，G重组基因型，在GENEBANK中找到与其相近的HBV全序列进行进化树分析，发现其不属于目前已有的分型；经查看参考文献，发现近年有文献报道类似的HBV全序列，有学者将其命名为基因型I，对本研究的标本进行全序列分析及S区氨基酸分析均支持将其分为新的基因型。时间树分析发现该新的基因型I分化年代约在1200年前。
　　结论：
　　（1）本课题组结合已有文献和引物设计工具，找到了一种能够对HBV全基因进行高保真PCR的方法，该实验方法能够保证检测的高灵敏度和高特异性，具有广泛的应用前景。
　　（2）对来自扶绥和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清标本的HBV全序列分析，我们研究发现了肝癌高低发区的HBV基因型和基因亚型分布存在显著差异；建立的B和C型参考序列为后续的研究提供了参考；发现的肝癌相关突变位点将为后续的肝癌早诊早治工作提供帮助。
　　（3）经过多序列比对和生物进化分析，本研究发现的四例HBV重组基因型最终确定为基因型I，这是在广西扶绥首次报道该基因型的存在，这完善了该基因型分布的地域资料并为NCBI基因分型工具提供了补充。

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中文摘要

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前言

第一部分 HBV全序列检测方法的建立

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.2 基因序列

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂

1.5 使用软件

1.6 实验方法

2 结果

2.1 引物的选择

2.2 引物结合能力的鉴定

2.3引物特异性的验证

2.4 PCR反应方案的确定

2.5 电泳结果

2.6 最终结果

3 讨论

第二部分 广西肝癌高低发区HBV分布差异及不同基因型致癌突变位点的筛选

1材料和方法

1.1研究对象

1.2 实验仪器及试剂

1.3 使用软件

1.4 实验方法

1.5 PCR产物纯化和测序

1.6 生物信息学分析

1.7 统计分析

2 结果

2.1 研究对象基本情况

2.2 PCR结果

2.3 测序峰图

2.4序列拼接和整理

2.5 基因型鉴定

2.6 不同地区基因型和亚型分布差异比较

2.7 基因型资料的多因素统计分析

2.8 HBV B和C基因型参考序列的建立

2.9 HBV前S和S区缺失变异分析

2.10 点突变分析

2.11 多因素分析

2.12 联合诊断分析

3 讨论

3.1 HBV基因型分布

3.2 前S区缺失突变

3.3 B基因型突变

3.4 C基因型突变

3.5 共同突变

3.6 联合诊断

3.7 存在的问题

3.8 总结

第三部分 广西扶绥HBV基因型I的发现及其进化分析

1 材料和方法

1.1研究对象

1.2 实验仪器及试剂

1.3 实验方法

2 结果

2.1 NCBI初步分型

2.2 全序列分析

2.3 重组分析

2.4 碱基差异率比较

2.5 前S和S区氨基酸对比

2.6 时间树分析

3 讨论

全文总结及创新点

参考文献

附录

综述：乙肝病毒变异及其临床意义

致谢