二去水卫矛醇在裸鼠体内对人NCI-H460肺癌细胞诱导凋亡的作用及其机制研究

摘要

目的：通过培养体外人NCI-H460肺癌细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，考察抗肿瘤药物二去水卫矛醇（DAG）对人NCI-H460肺癌细胞在裸鼠体内诱导凋亡的作用机制。
　　方法：1.对数生长期的NCI-H460细胞1×107/ml，取0.2ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下建立移植瘤模型；将裸鼠随机分成5组：A. NS组（6只）：腹腔注射等体积生理盐水；B. DAG-D组（6只）：腹腔注射DAG3mg/kg；C. DAG-Z组（6只）：腹腔注射DAG6mg/kg；D. DAG-G组（6只）：腹腔注射DAG9mg/kg；E.顺铂（DDP）组（6只）：腹腔注射DDP3mg/kg。每天1次，连续给药7天，给药后，裸鼠颈椎脱臼死亡后，剥离瘤块待用。
　　2.HE染色法观察病理形态学的改变；
　　3.TUNEL法检测DAG对移植瘤组织凋亡程度的影响；
　　4.实时荧光定量PCR检测不同给药组对相关凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53、Survivin、Cytm等表达的影响；
　　5.免疫组化染色观察DAG对对移植瘤组织中Bcl-2、P53、Caspase-3蛋白表达的影响；
　　6.蛋白印迹western blot法检测DAG对凋亡相关蛋白如Bcl-2、P53、Caspase-3的表达的影响。
　　结果：1.在给药之前各组裸鼠瘤体体积无明显差异；给药后各组裸鼠肿瘤的生长速度有明显差异（P＜0.05）。
　　2.HE染色后，光学显微镜下观察发现阴性对照组细胞形态无明显改变，坏死很少。而DAG各剂量组及顺铂给药组细胞生长密度较对照组降低，细胞形态有明显改变，坏死增多，并可见到细胞收缩、体积变小、核固缩蓝色深染的凋亡形态学改变。
　　3. TUNEL染色细胞凋亡检测结果显示，DAG可诱导裸鼠移植瘤组织出现肿瘤细胞凋亡。与阴性对照组相比，各组凋亡率分别为DAG低剂量组（3mg·kg-1）为6.34％，中剂量组为41.03%，高剂量组为75.13%，顺铂组为18.60%。
　　4.RT-PCR结果经分析可知，DAG作用于人肺癌细胞NCI-H460移植瘤裸鼠后，与阴性对照组相比，Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA的表达均上调，Bcl-2和Cytm mRNA的表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。而Survivin的表达变化不明显。
　　5.用于定位的免疫组化实验结果显示，DAG各剂量组和顺铂给药组能上调移植瘤组织中P53蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，且差异很显著。而Caspase-3蛋白的表达不明显。
　　6.用于定量的Western Blot检测结果显示，DAG各剂量组和顺铂给药组能提高移植瘤组织中Bax/Bcl-2和P53蛋白的相对含量，降低Caspase-3蛋白的表达。差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：本实验成功的建立了裸鼠NCI-H460移植瘤模型，初步验证了DAG可以诱导人非小细胞肺癌细胞NCI-H460在裸鼠肿瘤组织中的凋亡，并在分子水平上评价了DAG通过线粒体途径对人非小细胞肺癌细胞NCI-H460凋亡的影响。

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前言

一．NCI-H460肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及DAG作用后组织形态和细胞凋亡的检测

（一）NCI-H460肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立

(二) HE染色法检测肿瘤组织形态学的改变

(三) TUNEL法分析肿瘤组织凋亡的情况

讨论

二．RT-PCR技术检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53、Survivin、Cytm的mRNA在移植瘤中的表达

1 实验材料

2.实验方法

3.实验结果

讨论

三 免疫组化染色法和蛋白印迹western blot法检测Bcl-2、P53、Caspase-3的凋亡相关蛋白在移植瘤中的表达

（一）免疫组化染色法检测Bcl-2、P53、Caspase-3的凋亡相关蛋白在移植瘤中的表达

(二) 蛋白免疫印迹western blot法检测Bcl-2、P53、Caspase-3的凋亡相关蛋白在移植瘤中的表达

讨论

结论

参考文献

附录

综述：肿瘤干细胞的研究进展

摘要

1 肿瘤干细胞的研究现状

2 肿瘤干细胞的特性

3 肿瘤干细胞与肿瘤的关系

4．肿瘤干细胞的临床意义

5．展望

参考文献

致谢

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