食蟹猴脑缺血过程中皮层谷氨酸水平动态变化的研究

摘要

研究背景:中风(stroke)，又称卒中或脑血管病意外，是一组突然起病，持续时间至少24小时，以迅速发展的局灶性神经功能缺失为特征的急性脑血管疾病，其中以缺血性卒中最为常见。脑卒中具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，目前是世界第三大死因，在所有心脑血管病死亡中，脑卒中居第二位。目前全球范围内脑卒中的病死率有所下降，但中低收入国家的脑卒中幸存者和伤残调整寿命年在显著增加。在中国，脑血管病已成为我国居民首位死亡原因，且年轻人卒中死亡率呈上升趋势。研究证实，以谷氨酸兴奋性毒性为主要特征的神经毒性损伤，与卒中的发生发展、神经元的坏死和细胞的凋亡都存在密切的联系。卒中后的再灌注损伤成为目前亟待解决的问题。目前已证实一些神经保护剂可减少谷氨酸的释放，低温也可降低谷氨酸的释放，因此迫切需要了解缺血后谷氨酸的动态变化，以便认识神经细胞坏死的程度，从而为今后延缓或阻止细胞坏死提供药物治疗的评价依据。
　　现阶段在神经科学领域的实验研究中，微透析技术应用广泛，然而，新型电化学微电极传感器技术较微透析具有更多的优势，实验证明新型微电极对脑组织仅有70μM宽度损伤，而微透析则会造成250μM近圆形损伤，随着检测深度的增加，微透析技术势必会造成更大的损伤。此外，微透析检测方法不够统一，造成结果差异较大，灌流速率低，很难达到秒级的动态检测。电化学微电极传感器技术对多种神经递质和代谢物的检测方法基本一致，结果差异较小，更重要的是可以达到次秒级（1-1000Hz）的检测速率，实现真正实现了实时动态检测。目前该技术已应用于灵长类动物壳核、皮层，啮齿类动物纹状体、皮层、缺血皮层等谷氨酸的检测，还未有该技术应用于灵长类动物脑缺血皮层谷氨酸检测的报道。
　　目的:本研究拟通过对非人灵长类动物（食蟹猴）的研究，建立食蟹猴缺血性脑卒中模型，通过神经功能缺损评分和影像学表现评价临床表现，通过电化学微电极传感器技术检测皮层谷氨酸水平的实时变化，从而探讨:1.电化学微电极传感器技术在大动物（灵长类动物）皮层谷氨酸检测的可靠性，以及在食蟹猴缺血皮层谷氨酸检测的可行性和稳定性;2.食蟹猴缺血过程中皮层谷氨酸水平的变化规律;3.谷氨酸与神经功能损伤、缺血灶大小、血常规主要指标的关系;4.对食蟹猴缺血后皮层谷氨酸水平变化的初步观察和变化机制的初步探讨。灵长类动物作为转化研究中重要的实验对象和平台，运用此技术对灵长类动物缺血后皮层谷氨酸的实时检测，有助于了解谷氨酸水平的动态变化，为今后卒中机制和治疗药物转化研究提供一个可靠的技术手段和平台。
　　方法:
　　1.选取正常食蟹猴，采用夹闭左侧大脑中动脉(MCA) M1段1h(大脑中动脉夹闭术，MCAO)建立缺血再灌注的食蟹猴脑卒中模型。
　　2.采用神经功能缺损评分(NDS)分别在术前和术后第1、3、5、7、14天对缺血性食蟹猴进行神经功能评价。
　　3.应用磁共振成像技术(MRI)分别在术前、术后第1周和术后第2周对缺血性食蟹猴进行影像学评价。
　　4.分别在MCAO术前、术后第1周和术后第2周谷氨酸检测前抽取外周静脉血进行血常规分析。
　　5.应用电化学微电极传感器技术(FAST)检测MCAO食蟹猴术前、夹闭MCA M1时、夹闭放开后、术后第1周、术后第2周共五个时间点的猴运动区皮层谷氨酸水平的实时变化。
　　结果：
　　1.MCAO建立缺血性脑卒中模型。本实验通过MCAO手术，三只动物都成功的建立了脑缺血模型。术后三只动物均出现了神经功能损伤的症状，如右侧轻度面瘫、一过性共济失调、持续性右侧肢体偏瘫等。磁共振检查显示三只动物术后均出现了T2WI的左侧MCA供血区高信号，说明缺血灶形成，MRA显示左侧MCA M1近端不连续显影，说明MCA血流被阻断。
　　2.神经功能缺损评分。MCAO食蟹猴术前神经功能缺损评分均为0，神经缺损表现主要发生在术后一周内，呈持续加重趋势，观察到术后第5天偏侧瘫痪症状最严重，术前到术后第5天(35.3±11.4)的评分变化具有统计学意义，术后7天(35.5±18.4)到术后14天(25.5±12.6)的评分虽下降，但无统计学意义，说明神经功能症状在术后第1周至第2周趋于平稳。三只动物均在术后出现精神倦怠、反应迟钝、运动协调性下降、右侧肢体感觉消失或减退、右侧肢体偏瘫（以上肢最为严重）等，术后第一天到第二天能自主进食、饮水、梳理毛发，从第三天到第六天自主活动能力下降，少有进食、饮水、梳理毛发，从第七天起逐渐恢复自主活动，自主进食、饮水。
　　3.脑缺血过程中的磁共振影像学表现。实验食蟹猴术前MRI均显示正常的颅脑形态结构，双侧大脑半球内未见明显异常信号影，MRA示MCA M1正常连续显影，血流通常;术后第1周T2WI示左侧MCA供血区高信号，缺血灶形成，MRA示左侧MCA M1近端不连续显影，血流阻断;术后第2周T2WI示左侧MCA供血区仍为高信号，持续缺血灶，MRA示MCA M1出现连续显影，血流恢复。结果表明术后第1周缺血灶水肿体积(6.58±1.43) cm3较术前0 cm3明显增加，术后第2周水肿体积(4.89±1.02) cm3较第1周(6.58±1.43) cm3虽减小，但无统计学意义。
　　4.血常规分析。MCAO食蟹猴术后主要血常规指标在三个检测时间点呈现出不同的变化，其中，白细胞(WBC)持续上升，但无统计学意义;红细胞(RBC)持续下降，术后第1周较术前变化无统计学意义，术后第2周(4.7±2.0)×1012/L较术后第1周(5.3±0.2)×1012/L下降;血红蛋白(HGB)持续下降，术后第1周较术前变化无统计学意义，术后第2周(101±8) g/L较术后第1周(113±11) g/L下降;血小板(PLT)持续上升，术后第1周(489±68)×109/L较术前(319±48)×109/L上升，术后第2周较术后第1周变化无统计学意义。
　　5.脑缺血过程中的谷氨酸动态变化。MCAO食蟹猴皮层运动区谷氨酸浓度如下，术前基础浓度:(7.7±6.1)μM，夹闭MCA M1:(37.8±25.2)μM，夹闭放开:(38.3±25.1)μM;术后第1周:(12.2±9.5)μM;术后第2周:(23.7±26.1)μM。结果可知，在夹闭MCA M1时或夹闭放开后较基础浓度升高，夹闭放开后较夹闭MCA M1时谷氨酸浓度变化无统计学意义，术后第1周较夹闭MCA M1时或夹闭放开后谷氨酸浓度下降，术后第2周较术后第1周谷氨酸浓度变化无统计学意义。
　　6.神经功能缺损评分和谷氨酸的关系。MCAO食蟹猴术后第1周神经功能缺损评分与谷氨酸水平无相关性，术后第2周神经功能缺损评分与谷氨酸水平呈正相关。
　　7.缺血灶水肿体积和谷氨酸的关系。MCAO食蟹猴术后第1周皮层谷氨酸浓度与缺血灶水肿体积无相关性，术后第2周皮层谷氨酸浓度与缺血灶水肿体积呈正相关。
　　8.血常规主要指标和谷氨酸的关系。MCAO食蟹猴术后第1周皮层谷氨酸浓度与白细胞和红细胞数量成正相关，与血小板数量成负相关，与血红蛋白无相关性;术后第2周皮层谷氨酸浓度与血小板数量成正相关，与白细胞、红细胞、血红蛋白无相关性。
　　结论:MCAO可成功建立食蟹猴缺血性脑卒中模型。电化学微电极传感器技术(FAST)可以稳定而可靠检测皮层谷氨酸的动态变化，在脑缺血过程中通过FAST技术可检测特定时间点谷氨酸水平的实时变化。结果表明，缺血时可能加速皮层细胞外谷氨酸的释放，再灌注后谷氨酸的释放可能有所减弱或处于动态平衡。谷氨酸水平在缺血再灌注以及缺血的不同时间有相应的变化，且于肢体功能缺损严重程度、缺血灶体积存在相关关系，可作为评价脑缺血的一个客观的指标，为脑缺血机制研究、治疗药物的转化研究提供了新的可行性的途径。

目录

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摘要

前言

一、实验材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

文献综述 缺血性脑卒中动物模型的研究进展与现状

致谢

硕士期间论文发表

会议摘要

学术活动