巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴-猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究

摘要

本研究主要探讨巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴一猪异种核移植的相关技术问题。本论文包括两大部分，第一部分是文献综述，第二部分是试验研究。试验研究包括：(一)猪和食蟹猴体细胞培养体系的建立：(二)巴马小型猪体细胞核移植体系的建立；(三)PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响；(四)猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立；(五)食蟹猴-猪异种核移植的初步研究。试验研究的方法和结果可归纳为如下几点： 1．建立巴马小型猪睾丸成纤维细胞、耳部成纤维细胞、普通猪胎儿成纤维细胞和颗粒细胞的体外培养体系，并探讨其作为猪体细胞核移植供体的可能性。使用酶消化和组织块法成功分离培养了睾丸成纤维细胞，鉴定了其细胞类型，并且对其细胞周期与核心组蛋白(H3K9)乙酰化的关系进行了研究。结果表明，该培养体系可以支持上述几种细胞的体外生长。免疫荧光染色鉴定所分离到的细胞为睾丸成纤维细胞。两种同期化方法(血清饥饿和接触抑制)的结果显示：随着血清饥饿时间的延长G0+G1细胞的比例急剧升高后又趋于稳定，2d、4d组与70-80％汇合组差异显著(75.9％，95.9％vs.95.2％，P<0.05)，但2d、4d组差异不显著：细胞随着汇合度的增加G0+G1细胞的比例开始上升，接触抑制两天后基本趋于稳定，2d组、4d和6d组显著高于70-80％汇合组和100％汇合组(97.3％，95.0％，97.4％vs.74.7％，84.2％，P<0.05)。流式细胞仪分析显示：无论是血清饥饿还是接触抑制处理，G0/G1期供体细胞组蛋白乙酰化水平变化趋势基本相同，基本上是先升高后又降低。 2．建立了食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系，并探讨其作为猴同种体细胞核移植或异种体细胞核移植供体的可能性。分别使用酶消化和组织块法分离到了食蟹猴耳部成纤维细胞，间接免疫荧光法鉴定了其细胞类型并进行了核型分析。结果表明：该培养体系可以很好地支持该种细胞的体外生长，目前已传代到43代，生长仍旺盛；免疫荧光染色鉴定分离到的细胞为耳部成纤维细胞；对21代的细胞进行核型分析，核型正常。 3．本试验的目的是:A.掌握猪卵母细胞成熟过程中第一极体的位置随时间发生偏移的规律，为提高盲吸法去核效率提供依据；B.初步探讨胎儿成纤维细胞和颗粒细胞核移植效率；C.胚胎培养时添加胰岛素对孤雌激活和颗粒核移植胚胎发育率的影响；D.探讨简易融合仪对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明：在44-46h，有84.7％的极体位置偏移不超过30°，盲吸法的去核率基本与之对应，平均在88.1％，适于在本段时间进行去核。胎儿成纤维细胞、颗粒细胞核移植胚胎的囊胚率分别为9.9％和8.7％。Insulin无论对于颗粒细胞核移植胚胎(8.0％vs.2.4％，P>0.05)，还是孤雌激活胚胎均无显著促进作用(47.3％vs.44.3％，P>0.05)，但孤雌激活胚胎的囊胚显著高于核移植胚胎(47.3％和44.3％vs.8.0％和2.4％，P<0.05)。简易融合仪下，对于核移植胚胎，场强为200v/mm组的桑椹胚发育率均高于220v/mm组(33.3％，29.6％vs.17.1％，13.8％，P>0.05)：场强一定时，20μs组的桑椹胚率均高于40μs组．。随着场强的升高和脉冲时间的延长，桑椹胚发育率呈下降趋势。对于孤雌激活胚胎，20μs组的分裂率和囊胚率均高于40μs组，但差异不显著。 4．对睾丸成纤维细胞进行血清饥饿和接触抑制处理，寻找适宜的同期化方法，同时探讨了高代睾丸成纤维细胞重构胚胎的核重塑的规律，并比较了高代、低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维细胞重构胚胎的发育率。结果显示：接触抑制法处理供体，核移植胚胎融合率显著高于血清饥饿法(68．6％vs.55.3％，P<0.05)，胚胎囊胚率也高于后者(21.1％vs.14.1％；P>0.05)，但差异不显著：重构胚胎激活后3h，供体核的大小基本不发生变化，激活后6h，绝大多数重构胚形成膨大的类原核，到12h时，几乎所有重构胚形成膨大的类原核，并开始观察到重构胚分裂现象;低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维作为供体细胞时，重构胚胎的融合率均显著高于高代睾丸成纤维细胞(84.4％，79.1％vs.69.2％，P<0.05)，前两者的重构胚融合率也差异显著(84.4％vs.79.1％，P<0.05)，低代睾丸成纤维细胞作为供体细胞时重构胚胎的囊胚率显著高于高代睾丸成纤维细胞和耳成纤维细胞(13.9％，8.9％vs.6.4％，P<0.05)。 5．探讨了植物凝集素(PHA)对于化学激活、电激活孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明：添加适量PHA可以提高化学激活胚胎的囊胚率，10μg/mlPHA可以使囊胚率提高到54.1％：加入量大则有害；添加10μg/ml，20μg/ml的PHA可以显著提高体细胞核移植囊胚发育率(13.0％，5.6％Vs.5.0％，P<0.05)，10μg/ml组的囊胚率比对照组提高1倍多。总之，PHA对于化学激活、电激活和体细胞核移植胚胎的作用呈剂量依赖性，适量添加有助于三种胚胎的发育，过量则有害。 6．以胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞为供体构建的重构胚胎，利用刺入式胚胎移植法将其分别移入两头巴马小型猪和两头陆川猪的输卵管内。其中两头巴马小型猪和一头陆川猪返情，一头陆川猪怀孕到期，产下一头健康的雄性巴马小型猪。说明新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞核移植胚胎可以发育到期。 7．采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体构建猴一猪异种核移植胚胎，研究其核重编机制并寻找适宜的培养基，初步建立食蟹猴一猪异种核移植体系。结果显示：(1)重构胚胎激活后3h，供体核的大小基本不发生变化，但在激活后6h大部分形成膨大的类原核。(2)食蟹猴一猪异种核移植胚胎融合率为74.2％，有70.5％的重构胚胎发生卵裂，29％的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。(3)NCSU23+10％FCS和TCM199+10％FCS培养基中，重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5％和17.0％，NCSU23培养基为19.9％，但是只有在NCSU23+10％FCS和TCM199+10％FCS培养基中重构胚胎可以发育到囊胚阶段(1.4％vs.1.1％，P>0.05)，尽管差异不显著。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分文献综述

1 猪体细胞核移植国内外研究现状

2 异种体细胞核移植研究进展及存在问题

3 影响猪体细胞核移植效率的几个关键因素

3.1 供体细胞的类型及准备方案

3.2 胚胎重构策略

3.3 供体细胞的细胞周期与受体卵母细胞胞质的状态是否相协调

3.4 供体细胞重编程是否完全

4 研究的背景、目的和意义

第二部分 实验部分

第一章 体细胞培养体系的建立

第一节 猪体细胞培养体系的建立

第二节食蟹猴体细胞培养体系的建立

第二章 猪体细胞核移植体系的建立

第一节 普通猪体细胞核移植体系的初步建立

第二节 巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

第三章 PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响

1 材料与方法

2试验结果

3讨论

第四章 猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立

1材料

2结果

3讨论

第五章 食蟹猴-猪异种体细胞核移植的初步研究

1 材料与方法

4实验结果

5讨论

总结论

参考文献

附表

致谢

攻读学位期间发表文章情况