缫丝蚕蛹蛋白功能性质及谷蛋白糖基化修饰的研究

摘要

我国蚕桑产业发达，缫丝蚕蛹是缫丝产业的边角料，常作为动物饲料或是废弃物直接丢弃。而蚕蛹蛋白是一种符合人体营养需求的优质蛋白，但功能特性差的特点限制了其在食品工业中的应用。本研究从缫丝蚕蛹中提取四种蛋白组分，对其功能性质进行分析，并对谷蛋白进行糖基化修饰，以改善缫丝蚕蛹蛋白功能特性，增强其应用价值。本研究内容和实验结果如下:
　　采用了Osbom方法提取清蛋白(WP)、球蛋白(YP)、醇溶蛋白(AP)、谷蛋白(JP)四种蛋白组分:比较直接浓缩干燥、盐析以及等电点沉淀三种蛋白回收方法，得到等电点沉淀法最佳，四种蛋白纯度分别为88.19，71.03，34.45，87.44(％);SDS-PAGE凝胶电泳分析表明:WP由70kDa和32kDa亚基组成，YP、AP、JP的分子量分别为70kDa、14kDa、32kDa;四种蛋白的等电点依次是pH2.5，pH2.8，pH3.9，pH3.9。比较四种蛋白:WP的溶解性最强，其NSI值为97.19％，WP的持水性最强为6.35g/g;YP的乳化活性最弱为11.71m2/g，YP的NSI值最小为11.81％、但持油性最强为7.35g/g;AP的乳化活性最强为46.38m2/g;JP的表面疏水性最强为345.91;四种蛋白组分溶液都随剪切速度的增大呈现剪切变稀且同一种蛋白组分之间随着浓度的增大黏度也增大。温度会影响各蛋白组分溶液的粘度，其中对YP粘度变化影响最大，对WP的粘度变化影响最小。5％的AP溶液是典型的粘性流体。
　　采用糖基化的方法修饰缫丝蚕蛹谷蛋白。以接枝度及谷蛋白的乳化性为指标考察糖基化反应条件。单因素实验结果显示葡萄糖为糖基供体、反应温度110℃、反应时间1h、反应pH8、糖与蛋白质比为3∶1(w/w)较优;经响应面优化后的缫丝蚕蛹谷蛋白糖基化最优反应条件为:葡萄糖为糖基供体，糖与蛋白质质量比为3∶1(w/w)，pH8.2，118℃条件下，反应1.53h，在此条件下的样品的乳化活性为22.76m2/g。反应因素对乳化性影响的大小依次为:时间＞温度＞pH。经验证最优糖基化条件下得到的糖基化谷蛋白乳化活性为23.19m2/g，比糖基化前提高了34％,乳化稳定性也提高了150％。
　　比较糖基化修饰前后的蚕蛹谷蛋白功能性质及结构的变化。糖基谷蛋白的溶解性在pH为2-10的溶液环境下均有明显提高，特别是在等电点附近的溶解性明显升高，从空白组的0.04mg/mL提高到了0.31mg/mL;糖基化后的谷蛋白的乳化性仍受pH的影响，但相同pH条件下乳化性与原谷蛋白相比得到明显的提升。持水性方面从空白样品的4.66g/g提升到5.40g/g，持油性没有明显变化。糖基化修饰谷蛋白的相对分子量增加，部分氨基酸含量减少反映出缫丝蚕蛹谷蛋白分子上有糖基供体的接入;内源性荧光光谱、差示扫描量热仪、表面疏水性检测以及圆二色谱的检测结果显示经过糖基化后的谷蛋白结构发生了变化，疏水性增加，二级结构中的α，β结构减少，无规则卷曲增多;电镜观察发现谷蛋白表面呈紧密排列状，表面性检测结果显示糖基化修饰后的每个蛋白分子吸附面积会增大。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蚕蛹的开发利用现状

1．1．1 蚕蛹

1．1．2 蚕蛹在食品中的应用

1．1．3 蚕蛹在其他工业中的应用

1．2 蚕蛹蛋白的研究现状

1．2．1 提取

1．2．2 蚕蛹蛋白的生物活性

1．2．3 蚕蛹蛋白结构修饰与改性

1．3 蛋白质的改性研究进展

1．3．1 蛋白质改性方法

1．3．2 蛋白的糖基化改性

1．4 课题的研究意义、研究内容和技术路线

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 技术路线

第二章 蚕蛹蛋白组成、结构及其性质研究

2．1 实验材料

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 原料的处理

2．2．2 Osborn蛋白质分离操作

2．2．3 蛋白组分粗蛋白含量测定

2．2．4 蛋白组分氨基酸组成与总氨基酸含量测定

2．2．5 蛋白组分分子量测定

2．2．6 蛋白组分等电点测定

2．2．7 蛋白组分乳化性的测定

2．2．8 蛋白组分疏水性的测定

2．2．9 蛋白组分溶解性的测定

2．2．10 蛋白组分持水性及持油性的测定

2．2．11 蛋白组分流变性的测定

2．2．12 数据处理与分析

2．3．1．不同提取方法得到蚕蛹蛋白组分含量的结果分析

2．3．2．氨基酸组成的分析结果

2．3．3 蛋白组分的分子量分析

2．3．4 蛋白组分等电点分析

2．3．5 蛋白组分乳化性分析

2．3．6 蛋白组分溶解性分析

2．3．7 蛋白组分疏水性分析

2．4．8 蛋白组分持水性及持油性的测定

2．3．9 蛋白组分流变性的测定

2．4 本章小结

第三章 蚕蛹谷蛋白的糖基化结构修饰

3．1 实验材料

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 蚕蛹谷蛋白的制备

3．2．2 蚕蛹谷蛋白糖基化的制备

3．2．3 糖基化反应中单因素条件的确定

3．2．4 响应面优化

3．2．5 糖基化蛋白接枝度的检测方法

3．2．6 乳化性质的检测

3．2．7 数据处理与分析

3．3 结果与分析

3．3．1 糖基供体的的选择

3．3．2 反应温度的确定

3．3．3 反应时间的确定

3．3．4 反应pH的确定

3．3．5 反应糖蛋质量比的确定

3．3．6 缫丝蚕蛹谷蛋白糖基化工艺的响应面优化

3．3 本章小结

第四章 糖基化修饰蚕蛹谷蛋白功能性质检测及其结构分析

4．1 材料与设备

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 糖基化修饰缫丝蚕蛹谷蛋白的制备

4．2．2 溶解性检测

4．2．3 乳化性检测

4．2．4 持水持油性检测

4．2．5 热变性检测

4．2．6 氨基酸组成分析

4．2．7 分子量检测

4．2．8 荧光光谱分析

4．2．9 表面疏水性检测

4．2．10 表面性检测

4．2．11 电镜扫描

4．2．12 圆二色谱检测

4．2．13 数据处理与分析

4．3 结果分析

4．3．1 糖基化谷蛋白溶解性检测

4．3．2 蛋白乳化性检测

4．3．3 蛋白持水持油性检测

4．3．4 蛋白热变性分析

4．3．5 氨基酸结果结果分析

4．3．5 SDS-PAGE结果分析

4．3．6 荧光光谱结果分析

4．3．8 表面疏水性检测

4．3．9 表面性检测结果分析

4．3．10 电镜扫描

4．3．11 圆二色谱结果分析

4．3 本章小结

5．1 结论

5．2 不足与展望

5．3 创新点

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文