SARS病人PBMCs噬菌体展示抗体库及抑制性差减杂交库的构建与分析

摘要

严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)引起的以呼吸系统疾病为主要特征的全身系统性传染病，经常能够引起急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome)而导致患者死亡。据世界卫生组织(WHO)统计，截止到2003年7月，全球共发现可能的SARS病例8098例，其中774人死亡，分布范围遍布世界29个国家和地区。SARS不仅威胁到人们的健康和生命，而且给全球的社会、经济等很多方面也造成了非常深刻的影响，是一种对人类社会危害很大的恶性疾病。然而，迄今为止，人们尚没有找到有效治疗SARS的手段，并且对SARS的发病机理也缺乏了解。 SARS爆发期间，有一些医生用康复病人的血清来治疗危重病人取得了较明显的效果。研究表明，SARS康复病人体内普遍存在着中和抗体，而诸多的试验也证明中和抗体能够有效的治疗和预防SARS-CoV的感染。基于此，本文利用噬菌体展示技术对中和抗体的筛选进行了探索。 对SARS发病机理的不了解直接阻碍了我们寻找有效治疗SARS-CoV感染的手段。研究显示，外周血单核细胞(PBMCs)能够被SARS-CoV感染，并且淋巴细胞减少症是存在于SARS病人中一个很普遍的现象，这些现象说明，PBMCs(其中80-90％为淋巴细胞)是研究宿主对病毒感染产生免疫反应的一个比较好的实验材料。本文利用抑制性差减杂交技术对SARS康复病人PBMCs的基因表达变化进行了研究。 本论文的主要研究内容如下： (1)从SARS康复病人PBMCs中分离RNA，反转录成cDNA，以此为模板扩增出重链抗体可变区基因和轻链抗体可变区基因，利用Linker将两类可变区基因联系起来组成scFv，同噬菌体展示载体连接后，构建了一个容量为10<'6-7>CFU的噬菌体展示单链免疫抗体库。 (2)用原核表达载体重组表达具有中和抗体诱导活性的SARS-CoV Spike蛋白的S1段，得到了以包涵体形式存在的重组蛋白，通过变复性，得到了可溶性的S1蛋白，经免疫学鉴定，证明该重组蛋白能够被SARS阳性血清特异性识别。 (3)利用重组表达的S1蛋白，对构建的SARS噬菌体展示单链免疫抗体库进行了淘选，发现利用现有的淘选方法很难得到ORF正确的阳性单克隆抗体。随着淘选次数的增加，含全长插入片段的“全长片段克隆”的比例迅速下降，而其中含ORF正确的“全长片段克隆”的比例下降的更快，对普遍存在的含不完全插入片段的“短片段克隆”进行了研究，表明其ORF均是错误的。对这一现象的产生原因进行了初步探索。 (4)利用抑制性差减杂交技术对SARS康复病人PBMCs的基因表达变化情况进行了研究，发现与线粒体相关及与氧化还原作用相关的基因有明显的表达升高。免疫分子ILlB和HLA-DPBl表现出相对明显的表达上升，这同康复病人中普遍存在的较强的体液免疫反应可能有关。最让人感兴趣的是在发病之后17—19周，病人体内仍然有病毒RNA的存在，这大大超过人们之前的预期。另外有一些在此前利用基因芯片、双向电泳等手段进行的研究中所没有报道过的基因也表现出非常明显的表达上升。对SARS康复病人PBMCs还进行了薄层透射电镜分析，发现其中线粒体的数目发生了统计意义上的升高，并且溶酶体样颗粒明显增多。对这一现象进行了探讨、分析。 总之，本论文从临床应用和基础理论两个方面对SARS进行了研究与探索，在研究过程中既发现了存在的问题，也得到了有意义的研究结果，为今后进一步开展研究工作提供了借鉴、奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

1.1严重急性呼吸系统综合征概述

1.2噬菌体展示技术简介

1.3抑制性差减杂交简介

1.4本论文的研究目的和意义

1.5技术路线

第2章SARS噬菌体展示单链抗体库的构建

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

2.4小结

第3章 SARS-CoV Spike蛋白S1段的原核表达

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4小结

第4章SARS噬菌体展示抗体库的淘选及淘选条件的摸索与分析

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3讨论

4.4小结

第5章SARS病人PBMCs中基因表达谱的抑制性差减杂交分析

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3讨论

5.4小结

总结与展望

参考文献

缩略语

附录

攻读博士学位期间发表的论文和参与的课题

致谢

论文原创性声明